辣椒5個栽培種苗期耐冷性差異評價

錢恒彥,潘寶貴,刁衛平,戈 偉,郭廣君,劉金兵,陳學好,王述彬*

(1.揚州大學 園藝與植物保護學院,江蘇 揚州 225009;2.江蘇省農業科學院 蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室,江蘇 南京 210014)

辣椒(Capsicumspp.)起源于中南美洲熱帶地區,包含5個栽培種和22個野生種,其中5個栽培種分別為一年生辣椒(C.annuum)、中國辣椒(C.chinense)、漿果狀辣椒(C.baccatum)、灌木狀辣椒(C.frutescens)和絨毛辣椒(C.pubescens)[1]。辣椒為我國第一大蔬菜作物,冷害是我國保護地辣椒生產中主要的逆境因子[2]。選用耐冷辣椒品種為抵御冷害的有效措施之一,鑒定評價耐冷材料則為辣椒耐冷育種的首要任務[3]。

C.annuum通常具有優良的農藝性狀,是我國辣椒生產的主要栽培種類型[4]。在前人研究中,施加冷害脅迫條件,通過種子發芽指標(如發芽勢、相對發芽指數)、冷害指數、抗氧化酶(如SOD、POD、APX)活性、脯氨酸(Pro)含量、丙二醛(MDA)含量等指標,對C.annuum材料進行鑒定評價,并篩選出一批耐冷材料[5-9]。

研究結果表明,許多抗病、抗逆基因存在于C.chinense、C.baccatum、C.frutescens和C.pubescens這4個栽培種中；研究者通常采用種間雜交方法,將這4個栽培種的優異基因導入C.annuum,如抗炭疽病基因[10]、抗CMV基因[11]等,但與這4個栽培種耐冷性相關的研究與利用仍較少。

我們以分屬于5個栽培種的14份辣椒自交系為試驗材料,采用模糊隸屬函數分析方法,對辣椒苗期的耐冷性進行了綜合評價,以期篩選出耐冷性較強的辣椒材料,為深入研究辣椒的耐冷機理和材料創制提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究供試材料共有14份(見表1),其中A136、A270和P70為一年生辣椒(C.annuum), PI632927、PI596055和PI281320為漿果狀辣椒(C.baccatum), PI241650和Grif9238為中國辣椒(C.chinense), PI439512、PI439521和PI585251為灌木狀辣椒(C.frutescens), PI585270、PI593617和PI593632為絨毛辣椒(C.pubescens)。

表1 供試的14份辣椒材料的來源

1.2 冷脅迫處理

試驗在江蘇省農業科學院高效園藝作物遺傳改良重點實驗室進行。于2018年10月23日播種,50孔穴盤育苗,待幼苗長至4葉1心時,采用直徑15 cm、高12 cm的塑料花盆移栽,移入人工氣候室進入適應性生長,溫度為25 ℃/20 ℃(晝/夜)，光周期為12 h/12 h，光照強度為4000 lx，相對濕度為65%～70%。在適應生長7 d后,采用4 ℃±1 ℃進行冷脅迫處理,光周期、光照強度和相對濕度與適應生長期相同。

1.3 生理指標測定

分別在冷脅迫處理0、6、12、24、48 h時,采集同一部位去除葉脈的真葉,放入液氮速凍,于-80 ℃冰箱保存。每個重復采樣3株,混合取樣,于冰上操作,每個重復稱重0.1 g,3次生物學重復。采用北京索萊寶科技有限公司的試劑盒測定SOD活性(貨號BC0170)、POD活性(貨號BC0090)、MDA含量(貨號BC0020)、氧自由基(OFR)產生速率(貨號BC1290)、過氧化氫(H2O2)含量(貨號BC3590),采用南京建成生物工程研究所的試劑盒檢測Pro含量(貨號A107-1-1)。計算變異系數，其計算公式為：變異系數=標準偏差/平均值×100%。

1.4 數據處理

應用模糊數學隸屬函數分析法計算隸屬函數值[12]及平均隸屬度[13]。對SOD、POD、Pro采用以下公式計算隸屬函數值：隸屬函數值=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)。對MDA、H2O2采用以下公式計算隸屬函數值：隸屬函數值=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)。式中:Xij表示i材料j指標的測定值；Xjmin和Xjmax分別表示所有材料j指標的最小值和最大值；j表示某項指標。

采用Microsoft Office Excel 2010整理數據,應用DPS 7.05軟件進行數據處理、作圖和相關性分析,采用Tukey法進行多重比較分析,采用聚類分析法、隸屬函數法進行耐冷性分級評價。

2 結果與分析

2.1 冷脅迫對辣椒耐冷性的影響

當植物受到冷脅迫時,其抗氧化酶會清除植物體內的氧自由基,Pro含量會升高,有助于細胞組織保持含水量,防止植株脫水死亡。隨著冷脅迫時間的延長,植物體內H2O2含量及OFR產生速率都會增加,抗氧化酶無法及時清除,最終導致膜質過氧化。本研究結果(表2)表明,在冷脅迫處理48 h內,SOD活性總體呈現先上升再下降的趨勢,在6 h時達到峰值,且與0 h相比差異顯著(P<0.05)。POD活性在冷脅迫處理48 h內均值都高于0 h,且在12 h時達到最高,為1709.37 U/g。Pro含量在冷脅迫處理0～24 h期間下降,在24～48 h期間升高,且在冷脅迫48 h時較0 h上升0.07 μg/g。H2O2含量在冷脅迫0～12 h期間下降,在12～48 h期間升高。OFR產生速率在冷脅迫處理期間始終高于0 h時的。MDA含量在冷脅迫處理6 h時達到最大值61.98 nmol/g。

表2 不同時間冷脅迫處理對辣椒幼苗生理指標的影響

2.2 辣椒耐冷性鑒定的適宜脅迫時間

由表3可知,不同時間冷脅迫處理辣椒6項生理指標的變異系數差異較大,其中SOD活性、MDA含量和Pro含量這3項指標以12 h處理的變異系數最大,分別為0.31%、0.71%、0.49%,表明12 h冷脅迫處理能較好地反映不同辣椒材料間耐冷性差異。

表3 不同時間冷脅迫處理辣椒幼苗6項生理指標的變異系數

2.3 辣椒栽培種間耐冷性的差異

對4 ℃±1 ℃處理12 h的5個栽培種的生理指標進行分析，結果(表4)表明：3份C.annuum材料SOD活性的平均值最高(306.08 U/g)；3份C.pubescens材料POD活性的平均值最高(2508.43 U/g)；2份C.chinense的MDA含量最低(10.30 nmol/g)；3份C.pubescens材料的Pro含量比2份C.chinense材料高出8.98 μg/g；H2O2含量和OFR產生速率最低的栽培種分別為C.chinense和C.frutescens；3份C.pubescens材料的MDA含量比2份C.chinense材料高出39.15 nmol/g。在本研究分屬于辣椒5個栽培種的14份材料間，SOD活性、POD活性、Pro含量、H2O2含量、OFR產生速率均無顯著差異。

表4 冷脅迫處理12 h辣椒栽培種間生理指標的差異

2.4 辣椒耐冷性指標間的相關性

對冷脅迫處理12 h辣椒幼苗的6項生理指標進行相關分析,結果(表5)表明:SOD活性與POD活性呈顯著負相關(r2=-0.52*);MDA含量與POD活性呈極顯著正相關(r2=0.76**);POD活性與H2O2含量呈顯著正相關(r2=0.61*);MDA含量與Pro含量呈顯著正相關(r2=0.53*);Pro含量與H2O2含量呈極顯著正相關(r2=0.79**)；OFR產生速率與其他5個生理指標間無顯著相關性。說明冷脅迫對辣椒幼苗的生理影響是多方面的。

表5 冷脅迫處理12 h辣椒幼苗生理指標間的相關性

2.5 辣椒材料耐冷性的綜合評價

選取SOD活性、POD活性、Pro含量、MDA含量、H2O2含量5項生理指標(表6),采用隸屬函數法,對14份辣椒材料苗期的耐冷性進行綜合評價。由表6可知：C.annuumP70、C.annuumA270、C.chinensePI241650的平均隸屬度分別為0.63、0.59、0.58,具有較強的耐冷性;C.frutescensPI439521、C.baccatumPI632927、C.pubescensPI593632的平均隸屬度分別為0.43、0.46、0.46,耐冷性中等;C.pubescensPI593617的平均隸屬度為0.32,耐冷性較弱。

表6 不同辣椒材料耐冷性相關指標的隸屬函數值

2.6 辣椒幼苗耐冷性的聚類分析

采用類平均法(UPGMA),對經4 ℃±1 ℃處理12 h的14份辣椒材料的平均隸屬度進行聚類分析,結果如圖1所示。在歐式距離0.09處,將14份材料分為3個類別：第Ⅰ類別包括5份材料,分別為C.annuumP70、C.annuumA270、C.chinensePI241650、C.annuumA136和C.frutescensPI439512,占供試材料的35.71%,在冷脅迫處理12 h時植株表現為葉片下垂,無明顯失水癥狀,在冷脅迫處理24 h時植株表現為葉片下垂,無明顯失水癥狀;第Ⅱ類別包括C.baccatumPI632927、C.frutescensPI439521、C.chinenseGrif9238等8份材料,占供試材料的57.14%,在冷脅迫12 h時植株表現為葉片邊緣輕微失水,在冷脅迫24 h時表現為除頂部真葉外,其余真葉失水較為嚴重并出現水漬化現象,其中C.chinenseGrif9238在冷脅迫12 h、24 h時葉片出現褐斑;第Ⅲ類別僅包括C.pubescensPI593617這1份材料,占供試材料的7.14%,其在冷脅迫12 h時植株葉片出現水漬,并出現褐斑,在冷脅迫24 h時植株水漬化更加嚴重,褐斑增多。5個栽培種代表材料在冷脅迫后的植株表現結果見圖2。

圖1 14份辣椒材料苗期耐冷性的聚類分析結果

圖2 5個辣椒栽培種代表材料在冷脅迫后的表型變化

3 小結與討論

適當時間的冷脅迫處理是評價辣椒苗期耐冷性的一個重要因素。徐冉等以冷脅迫(15 ℃/8 ℃)處理辣椒幼苗,在冷脅迫處理10 d時辣椒幼苗的POD活性、Pro含量均達到最大值[14];經4 ℃冷脅迫處理48 h,耐冷材料‘湘研1號’葉片中的MDA含量呈上升趨勢,SOD活性高出處理前25.15%[15];經5 ℃冷脅迫處理15 d辣椒材料‘良椒2313’的SOD活性、POD活性、Pro含量、MDA含量在4份材料中最高[16]。前人模擬低溫進行耐冷性鑒定,通常采用單一時間處理,得到的試驗結果對耐冷性鑒定及耐冷機制分析具有一定的局限性。本試驗比較了辣椒苗期在冷脅迫處理中5個時間段的生理指標變異系數,發現在冷脅迫處理12 h時,3項生理指標SOD、MDA、Pro的變異系數最大,表明4 ℃±1 ℃冷脅迫處理12 h可以較好地反映出辣椒材料的耐冷性差異。

不同植物抵抗低溫的能力不同,致使低溫會對植物造成不同程度的損傷[17],嚴重時可導致植株死亡。辣椒苗期在受到冷脅迫時,細胞膜透性增加[18],細胞保護酶活性被抑制,從而降低對活性氧和自由基的清除,導致膜脂過氧化產物MDA的增加[19]；而Pro作為滲透調節物質能夠增加胞內溶質濃度,降低冰點,從而降低冷害對幼苗的傷害[20]。宋靜爽等[21]以辣椒低溫敏感型C.annuum‘A122’和耐低溫型C.annuum‘A188’為試驗材料,發現在4 ℃冷脅迫72 h內,其SOD活性以及Pro含量隨脅迫時間延長呈上升趨勢,而POD活性和MDA含量則先升高后降低;張武君等[22]以防城普通種‘金花茶’為材料,在3 ℃下低溫脅迫處理3～12 h，發現SOD活性呈下降趨勢,POD活性在3～6 h期間下降,在6～12 h期間上升,而Pro含量和MDA含量均呈上升趨勢;對4份番茄材料進行15 ℃/5 ℃、20 ℃/10 ℃冷脅迫處理，發現隨著溫度降低,番茄幼苗的SOD活性呈下降趨勢,而POD活性、MDA含量、Pro含量呈上升趨勢[23]。本研究發現：在冷脅迫處理48 h內,辣椒幼苗的SOD活性總體上呈現先上升再下降的趨勢;POD活性在冷脅迫處理48 h內均值都高于0 h時的;Pro含量在冷脅迫處理0～48 h期間呈現出先降低后升高的趨勢;H2O2含量在冷脅迫6 ～24 h期間呈下降趨勢,在24～48 h期間升高;OFR產生速率始終高于0 h時的;MDA含量在冷脅迫處理6 h時達到峰值后下降。本研究結果與前人的研究結果不盡相同,這可能與作物本身的生物學特性以及脅迫溫度和脅迫時間的長短有關。

植物的耐冷性是受多基因控制的數量性狀,耐冷機制十分復雜[24-25]。為了全面評價辣椒幼苗的耐冷性,應結合多個指標科學地評價幼苗的耐冷性[26]。使用隸屬函數法進行多項指標的綜合評價是目前普遍認為可靠的抗逆評價方法,該方法常用于辣椒[18]、黃瓜[27]、馬鈴薯[28]等作物的抗逆性評價。苗麗等采用隸屬函數法對102份嫁接黃瓜進行了評價,篩選出‘柿餅南瓜5Bb636-3(N67)’和‘三禾13-s08z13-3(N91)’等作為優異親本材料[29]。齊曉華等[30]采用隸屬函數法,從8份華北型黃瓜品種(系)中篩選出2份強耐冷的品系材料‘NY4’、‘NY5’和1份耐冷品種‘科普2號’。本實驗室丁夢佳等對44份辣椒材料在苗期與成株期的耐冷性進行了綜合評價,篩選出耐冷材料C.annuum‘A270’[31]。在本試驗中,C.annuum‘P70’、C.annuum‘A270’、C.chinense‘PI241650’、C.annuum‘A136’、C.frutescens‘PI439512’的平均隸屬度居前5位,在14份材料中表現出了較強的耐冷性。本研究實驗材料的平均隸屬度在閉區間[0～1]范圍內,利用平均隸屬度能比較準確地評價辣椒的耐冷性。

辣椒是世界性蔬菜作物和調味品,生產上的品種基本上都是C.annuum,因此前人研究辣椒耐冷性的試驗材料主要來自C.annuum,同時對C.annuum、C.chinense、C.baccatum、C.frutescens和C.pubescens這5個栽培種的耐冷性研究很少。本研究為了充分挖掘辣椒的耐冷基因,率先開展了辣椒5個栽培種的耐冷性綜合評價研究,除了在C.annuum中獲得了3份耐冷材料外,還在C.chinense和C.frutescens中分別獲得了1份耐冷材料。本研究擴大了辣椒耐冷的基因庫,這對后續辣椒耐冷機制的深入研究和耐冷材料的創制具有積極作用。

本研究結果表明：冷脅迫處理12 h可以較好地反映出辣椒5個栽培種14份材料苗期的耐冷性差異,因此12 h為辣椒冷脅迫處理的適宜時間；POD與SOD、MDA、H2O2間,Pro與MDA、H2O2間均存在顯著相關性；用隸屬函數法對SOD、POD、MDA、Pro、H2O2這5項生理指標進行綜合評價,得到耐冷材料C.annuum‘P70’、C.annuum‘A270’、C.annuum‘A136’、C.chinense‘PI241650’、C.frutescens‘PI439512’。