應用分子標記輔助選育香型優質稻九香粘

羅世友，胡蘭香，熊煥金，吳小燕，陳明亮，鄧 偉，陳大洲，肖葉青

(江西省農業科學院 水稻研究所/國家水稻改良工程中心南昌分中心/水稻國家工程實驗室,江西 南昌 330200)

香稻是一種自身含有香味物質，其香味能夠被人識別出來的特種稻。在國際市場上香米價格高出普通稻米2～3倍，印度的巴斯馬蒂香米和泰國茉莉香米正是因其獨特的香味而成為世界上最大宗的出口大米品種。江西省氣候溫暖，雨量豐富，無霜期長，屬中亞熱帶濕潤季風氣候區，特別適合種植水稻。全省水稻產量占糧食總產的90%以上，是1949年以來全國唯一不間斷輸出稻米的省份。根據國家水稻數據中心的統計[1]，自1985年實施品種審定以來，截至2019年，江西省農作物品種審定委員會共審定水稻品種948個。其中，贛晚秈31號是通過審定的第一個常規香稻品種，其谷粒具有茉莉香味。其后陸續審定了總共不到10個常規香稻品種，主要有2個方面的原因：一是為了解決我國的溫飽問題，長期以來對新品種的評價審定主要以產量為主要指標，忽視了品種的營養、口感等品質性狀，加上水稻品種的品質與產量一直是一對很難調和的矛盾，導致審定的香稻品種極其少。二是水稻的香味受第8號染色體上的隱性基因Badh2的調控，在選育過程中很容易丟失；雜交稻中只有不育系和恢復系同時攜帶香味基因，所有稻米才會有香味；不育系或恢復系只有一個攜帶香味基因，稻米的香味處于分離狀態，只有小部分稻米有香味，這增加了選育難度。隨著現代分子生物學技術的發展，分子標記輔助選擇技術已經得到了廣泛的應用，其通過利用與性狀基因緊密連鎖的標記進行檢測、追蹤目標基因，能夠在品種選育的早期世代獲得基因的純合體，這有助于提高育種效率，縮短育種年限，加快育種進程。

贛晚秈30號(原名923)是江西省農業科學院水稻研究所于2000年育成的一個晚秈優質稻品種[2]。923的分蘗力強，穗小結實率高，米飯有嚼勁，清香軟滑，外觀和口感與泰國大米相媲美，以至于出現用923大米冒充泰國香米進行銷售的現象。針對其產量偏低的問題，筆者從923的自然雜交后代中選育出了高產優質品種贛晚秈37號(原名926)[3]。926于2005年通過江西省農作物品種審定委員會審定，其米質達國標3級，外觀和食味品質與923相當，被列為2017年的江西省主推品種。隨著人民生活水平的不斷提高，普通消費者對日常消費的口糧品質提出了更高要求，香米因其口感好而成為市場追捧的對象。為了適應市場和消費者的需求，保持923品種的外觀和食味品質，增加香味特性，提高產量水平，筆者選用香稻品種美香占2號作母本與923雜交，通過分子標記輔助選擇攜帶香味基因的單株，結合農藝性狀的篩選，最終育成香稻品種九香粘。九香粘于2016年申報國家植物新品種權保護，2018年1月獲得授權(品種權號：CNA20160965.1)。2016年4月通過江西省農作物品種審定委員會審定(審定編號：贛審稻2016001)。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

923是一個優質晚秈稻品種，其分蘗力強，直鏈淀粉含量14.9%，米飯有韌性耐咀嚼，外觀和口感都很突出。美香占2號是廣東省農科院水稻所育成的優質香稻品種，具有株型好、分蘗力較強、結實率較高、熟色好、谷粒較小的特點。

1.2 分子標記的檢測

水稻葉片總DNA的提取采用CTAB法，稍加修改。具體方法：在裝有3 cm長新鮮葉片的2 mL離心管中加入600 μL的CTAB提取液，用高通量組織研磨儀研磨；將離心管移入65 ℃的水浴鍋中水浴30 min；在通風櫥往離心管中加入600 μL的氯仿，混勻5～10 min，在離心機上用12000 r/min轉速離心6 min，吸取上清液200 μL至準備好的1.5 mL離心管；在1.5 mL離心管中加入400 μL的預冷無水乙醇，混勻后放-20 ℃冰柜冷藏30 min，然后用12000 r/min轉速離心8 min，倒去無水乙醇，晾干；加ddH2O 200 μL溶解，-20 ℃冷藏備用。

PCR反應體系為10 μL,其中模板DNA 1 μL，引物 1 μL(上游引物和下游引物各0.5 μL)，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，10×PCR Buffers 1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶 0.25 μL，ddH2O 6.55 μL。PCR反應程序：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s；55 ℃、30 s；72 ℃、45 s，35個循環；72 ℃、10 min。采用8%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳顯影。Badh2基因的連鎖標記[4]：Badh2-E7上游引物序列：5′-GGTTGCATTTACTGGGAGTT-3′；下游引物序列：5′-CAGTGAAACAGGCTGTCAAG-3′。所有試劑及藥品均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.3 稻米品質性狀的檢測

參照農業部標準《食用稻品種品質》(NY/T 593─2013)方法，測定水稻的出糙率、精米率、整精米率、粒長、長寬比、堊白粒率、堊白度、膠稠度、直鏈淀粉含量等主要稻米品質指標。

1.4 產量測算方法

水稻成熟后適時收割，在太陽下晾曬3 d，去除癟粒和空粒，測量鮮重，采用稻谷水分快速測量儀測量曬干的稻谷含水量，根據公式：干重=[(1-鮮重含水量)×鮮重/(1-標準含水量)]，換算成干重，根據實割的稻田面積計算水稻的產量。

2 結果與分析

2.1 選育經過與方法

2008年夏季中稻應用美香占2號作母本與923構建組合美香占2號/923，同年冬季海南種植F1，剔除假雜株后混收種子。2009年秋季南昌晚稻種植F2群體，苗期取葉片檢測香味基因，采用系譜法進行熟期、株型和香味選擇單株，適當放寬選擇標準，多選單株。2009年冬季南繁種植F3株系，淘汰具有顯著缺點的株系。2010年秋季晚稻種植F4株系，每個株系種植50株，加大選擇壓力，在分蘗力強、株型偏緊湊、大穗和熟期稿色好的入選株系中，選擇具有香味的單株混收種子。2010年冬季南繁種植F5株系，選綜合性狀優良的株系混收。2011年秋季晚稻種植F6株系，每個株系種植100株，成熟期混收株系，進行米質品嘗，編號117488的株系表現食味口感好，有香味，安排冬季南繁加代繁殖。2012年秋季晚稻進行小區比較試驗，并進行移栽和直播試驗，表現出產量較高、抗倒性較好，送稻谷進行品質分析，命名為九香粘。

2.2 香味基因的檢測

在美香占2號/923組合的F2～F5分離世代的中間材料苗期提取葉片，應用Badh2-E7標記進行輔助選擇，標記攜帶香味基因純合型的單株，結合農藝性狀的考察，確定保留單株留種。檢測結果見圖1。

P1:美香占2號;P2:923;1～22:分離世代材料。

2.3 主要農藝性狀

九香粘為常規香型秈稻品種，莖、葉、糙米均有香味；株型緊散適中，長勢繁茂，莖稈較粗壯，株高124 cm，莖稈基部包莖節，分蘗力強，單株10個有效穗以上；葉色較淺，老葉葉尖和葉緣漸黃，劍葉微卷，倒二葉直立，葉下禾，后期落色好；穗大粒多，著粒較密，穗長約24.7 cm；平均每穗總粒數約151.6粒，每穗實粒數127.4粒，結實率84.0%，千粒重26.5 g；平均單穗重3.37 g。九香粘與923的主要農藝性狀對比見表1，從表1可以看出，九香粘的株高、結實率和全生育期與923的相當，產量的增加主要是通過增加穗長和每穗總粒數，從而提高單穗重來實現增產的目標。

表1 九香粘與親本923的主要農藝性狀的比較

2.4 主要品質

2015年經農業農村部食品質量監督檢驗測試中心(武漢)檢測：九香粘出糙率80.5%，精米率71.7%，整精米率62.0%，粒長7.0 mm，長寬比3.4，堊白粒率2.3%，堊白度4.6%，膠稠度72 mm，直鏈淀粉含量15.4%。九香粘與923的品質性狀對比見表2。九香粘在選育的過程中主要以923為對照，保留了923的粒型優勢，提高了出糙率和膠稠度，米質達國標3級，口感好，有香味。

表2 九香粘與親本923的主要品質性狀對比

2.5 產量表現

2015年區試平均產量為9032.1 kg/hm2，比對照Y兩優1號增產0.29%，差異不顯著。全生育期132.9 d，比對照Y兩優1號長2 d。2012年在永修縣燕坊村作一季稻直播試驗，平均產量7755 kg/hm2，未倒伏。2013年在江西省南昌縣塘南、向塘鎮、廣福鎮、星子縣、永修縣、宜豐縣、撫州和高安基地等地試種，產量接近或超過7500 kg/hm2，高產田塊達到9000 kg/hm2(廣福鎮)，產量表現較為穩定。2014年在江西省農科院高安基地示范試驗，人工移栽，經專家測產，產量8076 kg/hm2，未見明顯病蟲害。在永修縣種植1.5 hm2，人工移栽，平均產量8460 kg/hm2，未見稻瘟病；在湖口縣種植3.33 hm2，直播栽培，平均產量6930 kg/hm2，高產田塊7905 kg/hm2；在宜豐縣采取拋秧種植4.5 hm2，平均產量6165 kg/hm2，高產田塊8700 kg/hm2，抗病能力強。2015年在德安縣試種6.7 hm2，全部直播，6月1日播種，生育期128 d，經縣農業局組織專家現場測產，平均產量8904 kg/hm2。

3 小結與討論

江西省是我國糧食生產的11個主產區之一，長期堅持輸出稻米，為保障我國糧食安全作出了重要貢獻。在以產量為主要考核指標的水稻品種審定體系下，截至目前，江西省總共審定的常規香稻品種有贛晚秈31號(2002年審定)、贛晚秈39號(2009年審定)、贛晚秈40號(2015年審定)、美香新占(2016年審定)、九香粘(2016年審定)、洪香占(2019年審定)和贛香占1號(2019年審定)。所有常規香稻品種都是進入21世紀以后才審定的，這與我國的國情基本是相吻合的，20世紀的2次綠色革命——矮化育種和雜交稻育種，都是為了滿足人民的吃飽問題。隨著社會經濟的發展，人民生活水平的不斷提高，普通消費者對稻米的要求也提高了，不僅要吃飽，而且要吃好。這給水稻育種提出了新的課題，在保證產量的前提下，如何提高稻米品質成了新的研究方向。香味是稻米非常重要的食味品質性狀之一，香米因其香味濃郁、口感好而倍受消費者喜愛。

常規香稻品種的選育一般采用系譜選育法，所需育種時間長、效率低。分子標記輔助選擇育種是一種通過檢測與性狀基因緊密連鎖的標記達到高效定向選擇的目的，結合農藝性狀的篩選進行品種培育的方法。目前，該方法廣泛應用于水稻的常規稻和雜交稻父母本的培育與改良，已經有一些審定品種主要是通過應用該方法來提高其產量、品質和抗性等綜合性狀。莊杰云等[5]通過多基因聚合技術將抗稻瘟病基因Pib、Pita，抗白葉枯病基因Xa4、Xa13和優質基因Wx聚合到一起育成恢復系中恢161，配組成雜交稻新組合中優161。彭應財等[6-7]應用福恢838與攜帶白葉枯病抗性基因Xa21的IRBB21雜交建組，利用分子標記檢測和人工接種抗性鑒定相結合，育成高抗白葉枯病的恢復系中恢218。隨后育成雜交稻益豐優218和天優2180。吳俊等[8]應用分子標記輔助選擇技術，將馬來西亞普通野生稻中的增產QTLyld1.1和yld2.1導入9311中，育成高產恢復系R163，繼而育成雜交稻組合Y兩優7號。柳武革等[9]應用分子標記輔助選擇方法將Pi-1和Pi-2兩個基因導入榮豐B中，獲得改良保持系，然后通過回交轉育成抗稻瘟病的安豐A。陳志偉等[10]將抗稻瘟病基因Pi-9導入金山B-1中，回交轉育成M20A，通過測配育成雜交早稻M優2155。李金華等[11]利用分子標記輔助選擇技術將香味基因(frg)和低直鏈淀粉基因(wax)導入到天豐B中，然后通過回交轉育成優質不育系長泰A，隨后配組育成雜交稻長優736。

水稻的香味差異[12]是由Badh2基因的等位變異決定的，與香味有關的水稻品種常常包括其第7外顯子8 bp的缺失和3個單核苷酸多態性(SNPs)，或者第2外顯子7 bp的缺失。當Badh2基因在編碼區或者調控區域發生突變時，能夠產生無生物學活性的甜菜堿脫氫酶，導致水稻產生香味。目前，已經有研究者通過利用Badh2基因的緊密連鎖標記進行輔助育種培育出了香稻品種。李俊周等[13]利用香稻品種方欣4號與自育的高產抗病品種20106雜交，后經分子標記輔助選擇Badh2基因和產量品質性狀的篩選，培育出種綜合性狀好、穩產性好、米質優的香稻品種豫農粳11號。閆影等[14]以南粳46為母本，廣陵香粳為父本，采用分子標記輔助選擇方法聚合了香味等位基因Badh2-E7和低直鏈淀粉含量基因Wx-mq，結合直鏈淀粉含量測定和香味檢測，育成了優質早熟香稻新品種滬早香軟1號。朱小方等[15]以香型軟米水稻青香軟粳作為軟米基因供體親本,以香型非軟米水稻光明粳2號作為轉育親本,結合軟米基因分子標記輔助篩選,成功培育出了香型軟米水稻上師大18號。

本研究是以優質稻923為主要受體，通過分子標記輔助選育的方法，將美香占2號攜帶的香味基因導入其中，結合系譜選育的方法，農藝性狀的選擇以923為主要參考，定向選擇大穗型材料，經江西南昌和海南三亞兩地4年的穿梭育種培育成香稻品種九香粘。九香粘表現為產量高、品質優、稻米香、適應性廣的特點，2017年作為中國援助非洲剛果(金)的新品種[16]，在當地經過3個示范點種植測產結果，與當地2個品種(Moponga、Jasmine)對照，比Moponga增產21.3%，比Jasmine增產17.6%，增產顯著。