超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定蒲公英根和蒲公英葉中4種指標性成分的含量*

王超眾，王萌萌，魏強，邵丙俠，陳爽，張曉雪，董巍，孫輯凱

(1.齊齊哈爾市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江齊齊哈爾 161005；2.齊齊哈爾市第一醫院，黑龍江齊齊哈爾 161005；3.山西醫科大學，太原 030604；4.齊齊哈爾醫學院藥學院，齊齊哈爾 161006)

蒲公英為菊科植物蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz)、堿地蒲公英(TaraxacumborealisinenseKitam.)或同屬數種植物的干燥全草，具有清熱解毒、消腫散結、利尿通淋的功效[1]。蒲公英具有良好的廣譜抗菌、抗自由基、抗病毒、抗感染、抗腫瘤作用[2]，臨床上主要用于治療慢性胃炎、胃潰瘍、急性乳腺炎、盆腔炎、陰道炎、急性化膿性感染和泌尿系統炎癥等疾病[3]。蒲公英中化學成分種類非常多，主要為黃酮類、苷類、萜類、甾醇類、酚類、有機酸等[4]。蒲公英中酚酸類化合物含量豐富，尤其是咖啡酸含量較高，也是抗菌的主要成分[5]，《中華人民共和國藥典》(2015年版)采用高效液相色譜法測定其咖啡酸的含量，咖啡酸在葉、花、根中均有分布，但在根中含量明顯減少[6]，葉中咖啡酸的含量為根中4～6倍[7]。蒲公英主要活性成分不僅是酚酸類，還包括黃酮類[8]，而黃酮以木犀草素及其糖苷含量較高，而目前對于蒲公英根、蒲公英葉中黃酮類成分的含量差異報道較少，并且液質聯用法已成為檢測中藥成分的主要方法[9-10]，故筆者在本研究采用超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)法同時測定蒲公英根、蒲公英葉中對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷4種成分含量，為進一步研究蒲公英根和葉兩部位所含化學成分的差別及改進臨床應用提供科學依據。報道如下。

1 儀器與材料

1.1儀器 1290 infinity II型超高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；TSQ Quantum Access型三重四級桿質譜儀(美國Thermo Fisher公司)；Sartorius BP121S電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司，感量：0.01 mg)；CQ-250超聲波清洗器(上海必能信有限公司)；DFY-400高速萬能粉碎機(上海比朗儀器有限公司)。

1.2材料 對香豆酸對照品(批號：MUST-18050603)、木犀草苷對照品(批號：MUST-17121210)購于成都曼思特生物科技有限公司；咖啡酸對照品(批號：110885-201703)、木犀草素對照品(批號：111520-201605)購于中國食品藥品檢定研究院，含量均≥99.6%；乙腈(色譜純，天津Dikma)；甲酸(色譜純，天津Dikma)；水為超純水；其余試劑均為分析純。蒲公英樣品經齊齊哈爾醫學院孫輯凱副教授鑒定分別為東北蒲公英(TaraxacumohwianumKitam)、紅梗蒲公英(TaraxacumerythopodiumKitag)、白緣蒲公英(TaraxacumplatypecidumDiels)、戟片蒲公英(TaraxacumasiaticumDahl.)的全草，紅梗蒲公英采集于內蒙古莫力達瓦旗多熱博熱其勒村，其余品種采集于黑龍江省齊齊哈爾市。

2 方法與結果

2.1混合對照品溶液的制備 分別精密稱取對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷對照品適量，分別置于6個5 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解后稀釋到刻度，搖勻，用甲醇繼續稀釋，制得濃度分別為100 μg·mL-1的對照品儲備溶液。分別精密量取對照品儲備溶液2 mL，置同一個100 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，經孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，即得混合對照品溶液。

2.2供試品溶液的制備 精密稱取蒲公英粉末(過二號篩) 0.5 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇30 mL，密塞，稱定質量，超聲(功率250 W，頻率100 kHz)30 min，放冷，用70%甲醇補足失重，搖勻，經孔徑0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3色譜條件 色譜柱：Dikma Endeavorsil C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相：0.1%甲酸溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫條件：0～3 min，90% A； 3～7 min，90%→30% A；7～10 min，30% A；10～11 min，30%→90% A；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL。

2.4質譜條件 ESI離子源，正離子掃描，多反應監測模式，干燥氣溫度370 ℃，鞘氣流量10 Bar，輔助氣流量30 Bar，點噴霧電壓4 000 V，對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷監測離子對分別為165.1/119.0，181.1/135.2，287.2/153.2，449.3/287.1。見圖1。

2.5方法學考察

2.5.1線性關系考察 取“2.1”項下對照品儲備液適量，將對照品溶液分別稀釋10，20，50，100，200，1000，10 000倍，得到一系列濃度的對照品標準曲線溶液，經孔徑0.22 μm 微孔濾膜濾過后按“2.3”、“2.4”項下條件，進樣2 μL。以峰面積積分(Y)對濃度(X)進行線性回歸，繪制標準曲線。結果表明各成分在檢測濃度范圍內線性關系良好，結果見表1。

1.對香豆酸；2.咖啡酸；3.木犀草素；4.木犀草苷。

表1 4種成分線性關系考察結果

2.5.2精密度實驗 取“2.1”項下制備的混合對照品溶液，按“2.3” “2.4”項條件連續進樣測定6次，結果對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的峰面積RSD 分別為0.56%，0.77%，0.32%，0.58%，表明儀器精密度良好。

2.5.3重復性實驗 取同一批蒲公英樣品，蒲公英根和葉各取6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3” “2.4”項條件進樣測定，記錄各成分峰面積，計算得到蒲公英根中對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的含量RSD分別為 0.38%，0.68%，0.81%，0.50%，蒲公英葉中對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的含量RSD分別為 0.43%，0.37%，0.85%，0.57%，表明本方法重復性良好。

2.5.4穩定性實驗 精密吸取“2.2”項下的蒲公英葉供試品溶液各2 μL，分別在配制后 0，2，6，10，16，24 h進樣測定，記錄各成分峰面積，計算得到對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的峰面積RSD分別為0.32%，0.50%，0.44%，0.71%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.5.5檢測限、定量限實驗 將對照品標準曲線溶液繼續稀釋，在選定的色譜、質譜條件下，按照信噪比3：1計算，測得對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的檢測限分別為0.4，0.6，0.5，0.5 ng·mL-1；按照信噪比10：1計算，測得對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的定量限分別為1.2，1.8，1.5，1.5 ng·mL-1。

2.5.6加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的紅梗蒲公英根約0.25 g；每種各6份，分別加入100 μg·mL-1對照品儲備溶液0.01，0.1，0.02，0.025 mL；再精密稱取已知含量的蒲公英葉約0.25 g，每種樣品各6份，分別加入100 μg·mL-1的對照品儲備溶液0.1，1.5，0.5，0.5 mL，按“2.2”項下方法分別制備供試品溶液，按“2.3”“2.4”項條件進樣測定，計算得到對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷在蒲公英根和葉中的平均加樣回收率，結果見表2，表3。

2.6樣品的含量測定 對蒲公英根樣品和蒲公英葉樣品分別進行含量測定，結果見表4。

3 討論

本實驗采用UPLC-MS/MS法在15 min內同時測定對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷，該方法靈敏、準確、快速，可用于測定蒲公英根和葉不同部位中4個指標性成分的含量。實驗比較30%，50%，70%甲醇等不同提取溶劑，發現70%甲醇提取效果最好。同時比較回流、超聲提取方法，結果提取率差異無統計學意義，超聲提取簡便快捷，提取率高，故選擇超聲提取。

《中華人民共和國藥典》2015年版一部中蒲公英的質量標準只規定咖啡酸的含量限度，本研究選取酚酸類活性成分對香豆酸、咖啡酸，黃酮類活性成分木犀草素、木犀草苷為指標進行含量測定，從而達到對蒲公英根與蒲公英葉質量控制的目的。通過對蒲公英根、葉中的指標性成分含量進行比較，發現不同品種蒲公英葉所含指標性含量遠遠高于根，且木犀草素在根中未檢測到，而蒲公英中黃酮的含量以木犀草素含量最高，蒲公英的抗氧化活性就是基于其黃酮成分[11]，有文獻比較野生蒲公英根、葉提取物的抗炎作用，結果表明葉的抗炎作用優于根[12]，本研究含量測定結果與文獻報道一致。

表2 蒲公英根中4種成分的加樣回收率實驗

表3 蒲公英葉中4種成分的加樣回收率實驗

續表3 蒲公英葉中4種化學成分的加樣回收率實驗

表4 蒲公英根和葉中4種成分含量測定結果

蒲公英作為藥、食同源的中草藥，開發利用其資源已引起人們的重視，本研究建立了一種快速、準確、重復性好、分離度高的含量測定方法，可為蒲公英根、蒲公英葉的含量測定限度提供參考，也為評價其藥用價值及其合理利用蒲公英不同部位提供理論依據。