清血解毒合劑的高效液相色譜指紋圖譜研究*

熊鑫，黃傳奇，程璐

(武漢市第一醫院藥學部，武漢 430022)

清血解毒合劑(制劑批準文號：鄂藥制字Z20180184)是武漢市第一醫院的自制制劑，具有涼血解毒的功效，用于流火丹毒、急性皮炎、皮疹。本方由地黃、野菊花、牡丹皮、黃芩、當歸、甘草、赤芍、連翹、茯苓等9味中藥組成，日常以黃芩苷和芍藥苷為對照品的薄層鑒別作為質量檢驗的方法，但中藥化學成分復雜，還受產地、加工、儲藏、制備工藝等的影響，對于復方制劑而言單一的方法難以全面反映其質量，需要結合相應的指紋圖譜研究。中藥指紋圖譜研究是目前國內外普遍采用的中藥質量監督和管理模式，且很多復方制劑都有系統的研究以反映其質量的穩定性[1-7]。筆者在本實驗擬建立清血解毒合劑的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜研究方法，旨在為全面提高和完善清血解毒合劑的質量標準提供科學的實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(Waters2489紫外檢測器，四元泵，自動進樣器，柱溫箱)，BP211D電子天平(德國賽多利斯公司，感量：0.01 mg)。

1.2試藥 沒食子酸(批號：110831-201605，含量：90.8%)、原兒茶醛(批號：110810-201608，含量：99.4%)、兒茶素(批號：110877-201604，含量：99.2%)、咖啡酸(批號：110885-200102)、芍藥苷(批號：110736-201842，含量：97.4%)、甘草苷(批號：111610-200604)和黃芩苷(批號：110715-201720，含量：93.5%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純(美國TEDIA公司)，磷酸為分析純(天津市白世化工有限公司)，純化水自制；清血解毒合劑自制(批號：18122701，19010301，19011501，19012201，19021501，19021801，19030801，19042401，19042601，19050701)。

2 方法與結果

2.1色譜條件 伊利特C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，2%→6%A；10～15 min，6%→10%A；15～30 min，10%→20%A；30～45 min，20%→22%A；45～55 min，22%A；55～65 min，22%→25%A；65～85 min，25%→40%A；85～86 min，40%→2%A；86～90 min，2%A)[8-18]，柱溫30 ℃，檢測波長230 nm，流速1.0 mL·min-1，進樣量10 μL。

2.2對照品溶液制備 精密稱取減壓干燥至恒重的沒食子酸、原兒茶醛、兒茶素、咖啡酸、芍藥苷、甘草苷和黃芩苷對照品適量至25 mL量瓶中，加80%甲醇溶解定容，搖勻，分別制成對照品溶液。再精密吸取各對照品溶液適量至同一量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，即得混合對照品(濃度分別為沒食子酸102.5 μg·mL-1、原兒茶醛118.7 μg·mL-1、兒茶素105.3 μg·mL-1、咖啡酸117.7 μg·mL-1和芍藥苷112.5 μg·mL-1、甘草苷135.5 μg·mL-1、黃芩苷151.4 μg·mL-1)。

2.3供試品溶液制備 精密移取本品5 mL至25 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，以孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4方法學考察

2.4.1精密度實驗 將清血解毒合劑(批號：18122701)按“2.3”項方法制備供試品溶液，并按“2.1”項色譜條件連續進樣，測定6次，記錄共有峰保留時間和峰面積，以26號黃芩苷為參照峰，測得樣品的各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均<3.00%，說明儀器的精密度良好。

2.4.2穩定性實驗 將清血解毒合劑(批號：18122701)按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別于0，2，4，8，16，24 h內進樣，記錄共有峰保留時間和峰面積，以26號黃芩苷為參照峰，測得樣品的各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均<5.00%，說明供試品室溫下的穩定性良好。

2.4.3重復性實驗 取相同批號(批號：18122701)的清血解毒合劑，按“2.3”項制備方法，同時平行制備樣品6份，并按“2.1”項色譜條件進樣，記錄共有峰保留時間和峰面積，以26號黃芩苷為參照峰，測得樣品的各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均<5.00%，說明該方法重復性良好。

2.5指紋圖譜的建立及分析

2.5.1指紋圖譜的建立 取10批清血解毒合劑，按“2.3”項方法制備樣品，按“2.1”項色譜條件分別進行測定，并記錄共有峰保留時間和峰面積。將10批供試品的HPLC圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2010版)軟件，選擇S1為參照圖譜，中位數法，時間寬度為0.5，進行匹配，隨即建立清血解毒合劑的指紋圖譜，并生成對照色譜圖R，見圖1。

圖1 10批清血解毒合劑HPLC指紋圖譜及對照圖譜

2.5.2共有峰的確定及參照峰的選擇 根據10批清血解毒合劑的保留時間和峰面積計算，以及對照圖譜R的參考，選取36個峰形好，保留時間和峰面積穩定的峰為清血解毒合劑的共有特征峰，且其中26號色譜峰黃芩苷分離度好，峰面積穩定，峰型好，故選黃芩苷為本制劑HPLC指紋圖譜的參照峰，見圖2。

圖2 共有峰HPLC色譜圖

2.5.3色譜峰的指認 根據分析清血解毒合劑單味藥的成分，對比已知對照品，確定了指紋圖譜中7個峰的成分，分別為沒食子酸、原兒茶醛、兒茶素、咖啡酸、芍藥苷、甘草苷和黃芩苷，見圖3。

1.沒食子酸；2.原兒茶醛；3.兒茶素；4.咖啡酸；5.芍藥苷；6.甘草苷；7.黃芩苷。

2.5.3相似度評價 對10批清血解毒合劑采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2010版)軟件進行指紋圖譜分析，得到的10批樣品和對照指紋圖譜的相似度，見表1，且以26號黃芩苷為參照峰，計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積，見表2，3。

3 討論

3.1波長的選擇 本制劑中共9味中藥，根據《中華人民共和國藥典》(2015年版)藥材項下含量測定的內容和部分文獻參考分析總結，并結合全波長掃描的結果，選取270，250，230，220 nm作為樣品的預測波長，綜合觀察分析，在波長230 nm處，樣品的色譜峰豐富，分離度好，基線平穩且能有多個已知對照品能與樣品色譜圖中的峰對應上，作為指紋圖譜分析，有多個特征峰及指認峰，能較好地展現樣品的HPLC峰形，故選擇230 nm作為清血解毒合劑指紋圖譜的檢測波長。

表1 10批清血解毒合劑指紋圖譜相似度結果

表2 10批清血解毒合劑共有峰的相對保留時間

續表2 10批清血解毒合劑共有峰的相對保留時間

表3 10批清血解毒合劑共有峰的相對峰面積

續表3 10批清血解毒合劑共有峰的相對峰面積

3.2流動相的選擇 本實驗按參考文獻的流動相選擇甲醇-0.1%或0.05%磷酸溶液、甲醇-水、乙腈-0.1%或0.05%磷酸溶液系統來對清血解毒合劑的樣品進行流動相的選擇，結果顯示，在乙腈-0.05%磷酸溶液的梯度下，色譜峰分離度良好，無前延或者拖尾等現象，故選擇此流動相并調整梯度到樣品色譜峰峰型和分離度最佳。

3.3特征峰及參照峰的選擇 根據文獻選取常見已知對照品在波長230 nm處與本制劑色譜峰進行比對，標出沒食子酸、原兒茶醛、兒茶素、咖啡酸、芍藥苷、甘草苷和黃芩苷這7個指認峰，且黃芩苷在230 nm處峰型好，保留時間穩定，峰面積大，特征性強，故選取黃芩苷為參照峰。在本制劑的色譜峰中，標出的36個特征峰，均以黃芩苷為參照峰計算相對保留時間和相對峰面積，結果良好。在共有色譜峰中，29～32這4個色譜峰在共有峰中分離度不佳，但在單獨的10批色譜峰中，這四個峰分離度、相對保留時間和相對峰面積均良好。觀察整個色譜峰，30～40 min這一段分離度不夠好，考慮降低有機相比例或減慢流速，但效果不佳，還延長整個色譜峰的出峰時間，故選擇緩慢增加有機相，在最佳的流動相比例下完成色譜圖。

本實驗中，10批清血解毒合劑的指紋圖譜的相似度均在0.833～0.987，大部分相對峰面積和相對保留時間均在合理的范圍內，表明清血解毒合劑各批次間無明顯的差異，飲片質量穩定、制備工藝純熟，且本實驗建立的指紋圖譜方法簡單、可靠，操作重復性強，可用于清血解毒合劑的質量標準的檢驗。