黃連降脂合劑的質量標準研究*

黃蕾，劉新國，程璐，黃文濤，胡松

(武漢市第一醫(yī)院藥學部，武漢 430022)

黃連降脂合劑由經驗效方與現代制劑技術相結合研制而成，由黃連、葛根、天麻、陳皮、法半夏、三七粉組成，組分獨特，具有燥濕化痰、活血化瘀功效，用于高脂血癥、動脈粥樣硬化、冠心病，療效顯著，是我院長期院內經驗效方，經長期用藥觀察，該效方對心血管疾病有較好療效。在前期對君藥黃連含量測定的基礎上，筆者在本研究增加質控，進一步完善黃連降脂合劑質量標準。

1 儀器與試藥

1.1儀器 ME215S型電子分析天平(Sartorius公司，感量：0.01 mg)；Essentia LC-16型高效色譜儀(日本島津公司)；超純水儀(上海惠分科學分析儀器有限公司)；數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；硅膠板(青海海洋化工廠分廠)。

1.2試藥 黃連降脂合劑(武漢市第一醫(yī)院制劑中心，批準文號：鄂藥制字Z20200014，批號：2017052200，2017052300，2017052400)；葛根素對照品(批號：110752-201615，含量：95.4%)、鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-201212)、三七對照藥材(批號：120941-200304)，均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純(美國Fisher公司)；其他試劑為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1黃連薄層色譜鑒別

2.1.1供試品溶液的制備 取本品，搖勻，取50 mL，用三氯甲烷振搖提取2次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2對照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3陰性溶液的的制備 取不含黃連藥材的樣品50 mL，按供試品溶液制備的相同方法，制成陰性對照溶液。

2.1.4鑒別 照薄層色譜法(2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則0502)實驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10：6：1：1)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外燈(波長365 nm)下檢視[1-2]。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的黃色熒光斑點，陰性對照無相應的斑點，見圖1。

1.黃連降脂合劑(17052200)；2.黃連降脂合劑(17052300)；3.黃連降脂合劑(17052400)；4.鹽酸小檗堿對照品；5.缺黃連陰性對照品。

2.2三七的薄層鑒別

2.2.1供試品溶液的制備 取本品，搖勻，取80 mL，用三氯甲烷振搖提取2次，每次50 mL，棄去三氯甲烷液，水液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次50 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次50 mL，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次50 mL，棄去水洗液，正丁醇液蒸至近干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.2.2對照品溶液的制備 取三七對照藥材1.0 g，加水5 mL潤濕，與“2.2.1”項自“用水飽和的正丁醇振搖提取2次”起，同法制成對照藥材溶液。

2.2.3陰性溶液的制備 取不含三七藥材的樣品80 mL，按供試品溶液制備的相同方法，制成陰性對照溶液。

2.2.4鑒別 照薄層色譜法(2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則0502)實驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)10 ℃以下放置分層的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，日光下顯相同顏色的斑點[3-4]。陰性對照無相應的斑點，見圖2。

1.黃連降脂合劑(17052200)；2.黃連降脂合劑(17052300)；3.黃連降脂合劑(17052400)；4.三七對照藥材；5.缺三七陰性對照品。

2.3黃連降脂合劑中葛根素的含量測定

2.3.1色譜條件 《中華人民共和國藥典》2015年版一部關于“葛根”項下藥材的含量測定方法，筆者對流動相比例進行篩選，比較改變流動相比例后，根據色譜峰的變化，最終確定色譜條件，色譜柱：C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇-水(25：75)，檢測波長：250 nm，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃，進樣：10 μL，理論板數按葛根素峰計算應不低于2000。在此條件下，樣品中葛根素與其他組分能夠達到基線分離，與相鄰的色譜峰分離度>1.5，葛根素的理論板數>5000[5-7]。

2.3.2對照品溶液的制備 精密稱取葛根素14.23，14.70 mg，分別置10 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液，再精密量取1 mL，分別置20 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.3.3供試品溶液的制備 取本品(批號：17052200)，搖勻，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，經孔徑0.45 μm濾網濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3.4陰性溶液的制備 按處方量稱取除葛根以外其余5味藥材，加水10倍量，浸泡1.5 h，煎煮提取2次，每次1 h，濾過，合并濾液，將濾液加熱濃縮至相對密度為1.04～1.08(40 ℃)。稱取苯甲酸鈉0.6 g，加水10 mL煮沸使溶解，加入上述濃縮液中，以純化水調整全量至200 mL，搖勻，濾過，按“2.3.3”項葛根供試品溶液制法制備即得。

2.4方法學考察

2.4.1專屬性實驗 在選定的色譜條件下，分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測定，結果供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，有相同保留的色譜峰，而陰性溶液在此保留時間無干擾，見圖3。

2.4.2線性關系實驗 精密稱取葛根素14.23 mg，置于10 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液(1.36 mg·mL-1)，分別精密移取此儲備液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置10 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，在上述色譜條件下分別進樣10 μL，分別進樣2次，測定峰面積，計算平均峰面積，以平均峰面積、對照品含量計算線性回歸方程：Y=5 239 190.5X-17 542.4，r=0.999 9；表明葛根素在27.15～135.75 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.4.3精密度實驗 取葛根素對照品溶液，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，進樣10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結果RSD為0.04%。

2.4.4穩(wěn)定性實驗 取黃連降脂合劑樣品(批號：17052200)搖勻，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。分別于0，2，4，8，12，24 h進樣10 μL，記錄峰面積，結果RSD為1.05%，表明溶液在24 h內穩(wěn)定。

A.陰性樣品；B.對照品；C.供試品；1.葛根素。

2.4.5重復性實驗 取黃連降脂合劑樣品(批號：17052200)6瓶，搖勻，分別精密量取1 mL，分別置于100 mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，分別進樣10 μL，按上述色譜條件測定葛根素的平均含量為6.99 mg·mL-1，RSD為1.47%。

2.4.6回收率實驗 取已知含量樣品(批號：17052200)6份，搖勻，精密量取0.5 mL，分別置于100 mL量瓶中，精密稱取葛根素35.58 mg，置10 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液，精密移取此儲備液1.0 mL，分別置100 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，分別進樣10 μL，按上述色譜條件測定含量，計算回收率，結果平均回收率為97.00%，RSD為1.62%，見表1。

表1 黃連降脂合劑加樣回收率實驗結果

2.4.7耐用性實驗 取本品(批號：17052200)，搖勻，分別精密量取1 mL，分別置于100 mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，分別進樣10 μL，在3根不同的色譜柱上測定葛根素的含量，結果表明葛根素在3根不同的色譜柱上測定結果無明顯差異，見表2。

表2 不同色譜柱測定葛根素含量結果

2.5樣品測定結果 取不同批次的黃連降脂合劑樣品各1 mL，按“2.3.3”方法制備供試品溶液，分別吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，按外標法計算含量，平均含量為7.01 mg·mL-1，最低濃度為6.51 mg·mL-1，綜合平均濃度和最低含量批次基礎上，下浮30%，暫擬定本品的含量限度為每毫升含葛根以葛根素(C21H20O9)計，不得少于4.56 mg，結果見表3。

表3 3批黃連降脂合劑樣品含量測定結果

3 討論

3.1含量測定指標的選擇 為體現中藥制劑在中醫(yī)理論指導下的組方配伍原理，制劑質量標志物的確定應遵循組方配伍，以君藥為主，臣、佐、使藥兼顧的原則[8]。黃連降脂合劑處方中君藥黃連應作為含量測定的指標性成分，前期對君藥黃連相關成分進行含量測定，結果顯示黃連中主要成分轉移率分別為：表小檗堿12.96%、黃連堿10.64%、巴馬汀15.67%、小檗堿13.77%，表明水提方法對黃連生物堿類提取效率較低，這些在水中溶解性較差的成分難以成為全方水提效果的衡量指標，因此未予采用。葛根作為臣藥在處方中用量最大(42.25%)，用HPLC法測定其中所含有效成分葛根素含量的方法成熟準確，參考有關文獻，擬定用HPLC法對葛根素進行含量測定，并進行方法學研究及3批供試品的含量測定，結果表明葛根素在27.15～135.75 mg·mL-1范圍內線性關系良好，3批樣品含量測定結果均在擬定的含量限度內，證明該方法穩(wěn)定可行，故將該指標收載入含量測定項下。

3.2薄層色譜鑒別的選擇 對黃連降脂合劑除葛根以外的藥味，逐一分析薄層色譜鑒別。黃連以鹽酸小檗堿對照品，進行薄層色譜鑒別，分離效果較好，供試品與對照品在相應的位置上顯相同顏色的黃色熒光斑點，陰性對照無干擾，方法可行，故納入質量標準。三七以三七對照藥材進行薄層色譜鑒別，分離效果較好，供試品色譜與對照藥材在相應的位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，方法可行，故納入質量標準。天麻以天麻素對照品進行薄層色譜鑒別，與對照品色譜相應的位置上，主斑點不明顯，且與其他斑點未分離，陰性對照有干擾，方法不可行，故未納入質量標準。甘草主要化學成分為甘草甜素、甘草次酸、甘草苷等，法半夏在2015年版《中華人民共和國藥典》中鑒別成分為甘草次酸，二者所含成分相互干擾，因此甘草、法半夏兩味藥材的薄層色譜未納入質量標準。