小劑量環磷酰胺治療尖銳濕疣對角質形成細胞的干細胞性及分化影響*

吳佳懌，諶素素，曹育春，張勇

(1.北京大學腫瘤醫院病理科，北京 100142；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院皮膚科，武漢 430030；3.武漢友芝友生物制藥有限公司，武漢 430075)

尖銳濕疣(condyloma acuminata，CA)是由人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染引發的常見性傳播疾病，人類是其唯一的宿主。CA的復發仍然是目前臨床治療的難題，尋求有效防治CA復發的措施也是目前研究的熱點。筆者前期研究發現小劑量環磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)可選擇性地消減FoxP3+Treg細胞，而其他T細胞亞群不受影響[1-2]，表明小劑量CTX能夠降低抑制性免疫細胞。筆者建立的CTX治療CA “間歇、短程、小劑量”治療方案(CTX 1 mg·kg-1·d-1，連續服藥7 d，停3 d為一個療程，共3～6個療程)，經研究也能夠改善CA局部細胞免疫功能，有效抑制CA疣體的生長[2]，并降低CA復發[3]。同時，該療法費用低、毒副作用不明顯。因此，小劑量CTX治療CA具有很好的潛在臨床轉化價值，然而其具體作用機制值得進一步研究。

CA組織病理表現以表皮角質形成細胞(keratinocyte，KCs)及棘層增厚呈乳頭瘤樣增生為主，其中的表皮KCs的增殖無疑起源于表皮中的干細胞或具有干細胞性的短暫擴增細胞。筆者前期也觀察到該療法治療后有較大比例的患者疣體縮小，甚至消退，針對其具體的分子機制，認為疣體的產生與消退與KCs的增殖及分化密切相關。基底層中表皮干細胞占基底層細胞總數1%～10%[4-5]，表皮干細胞能夠增殖分化為表皮組織中的各種細胞。因此，筆者進一步研究將小劑量CTX對CA疣體的作用機制，并聚焦于其是否影響CA疣體中KCs的干細胞性及細胞終末分化能力，報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料與分組 以初發CA患者20例為對照組(CA組)，其中男10例，女10例，均為首次確診的CA患者；小劑量CTX治療CA患者8例為治療組(CTX組)，男5例，女3例，給予CTX 1 mg·kg-1·d-1，連續服藥7 d，停3 d為1個療程，共治療3個療程。兩組CA患者均不伴有其他性傳播疾病和病毒性感染疾病，且無其他嚴重的系統疾病，患者近4周未用糖皮質激素或免疫抑制劑。空白對照組(NS組)10例，為泌尿外科包皮環切的男性患者，既往無不潔性交史，本人及配偶無CA等性傳播病病史，且無其他嚴重的系統性疾病，且近4周未接受糖皮質激素或免疫抑制劑治療。所有CA患者均為2017年3—10月就診于華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院皮膚科患者，NS組為2017年5—10月就診于同院醫院泌尿外科患者，且所有患者均為成年人。

1.2儀器與試劑 兔抗人P63抗體(批號：12143-1-AP)，兔抗人整合素α6(integrin α6，ITGA6)抗體(批號：27189-1-AP)，兔抗人KRT10抗體(批號：16855-1-AP)，兔抗人Cytokeratin19抗體(批號：10712-1-AP)，均購于三鷹生物技術有限公司。

1.3實驗方法 取初發CA患者、CTX治療3個療程后，CA患者疣體及NS組患者包皮組織，經甲醛固定、石蠟包埋、切片，采用標準免疫組化法進行染色，石蠟切片常規脫蠟，然后經檸檬酸緩沖液浸泡進行抗原修復。用3% 過氧化氫(H2O2)阻斷內源性過氧化物，接著用山羊血清封閉室溫孵育。然后順序加入一抗、二抗，DAB顯色，最后使用弱氨水進行返藍，進行切片脫水和封片以便后續觀察研究。

1.4結果判定標準 P63以細胞核或細胞質中出現明顯的棕黃色染色顆粒或深棕褐色染色顆粒為陽性判斷標準；ITGA6和K10以細胞膜或細胞質中出現明顯棕黃色染色顆粒或棕褐色染色顆粒為陽性判斷標準。具體結果判定方法參照文獻[6]。將每張免疫組化染色切片統一在光學顯微鏡下放大至200倍，按照類似等距抽樣的方法原則，共取視野5個，計算每一個視野中免疫組化染色為陽性的細胞占所有細胞的百分比，取平均值。將陽性細胞百分比0%～5%標記為“-”，>5%～25%標記為“+”，>25%～50%的標記為“++”，>50%標記為“+++”。統計每個等級的切片數量。

1.5統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，并采用秩和檢驗對等級資料進行差異性分析，Spearman等級相關處理用于兩組變量間的相關性研究，結果認定：α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1P63的表達 P63在正常組織中主要表達于表皮基底層； CA組表皮基底層、棘層以及顆粒層中均有表達； CTX組CA組織中主要表達于表皮基底層，在棘層中也可能出現少量的陽性表達。見圖1。3組P63免疫組化表達結果見表1。P63在CA組內表達最多，表達量明顯高于NS組和CTX 組，均差異有統計學意義(P<0.01)。但是P63在NS組和CTX組中表達差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2ITGA6的表達 ITGA6在細胞內主要定位于細胞漿和細胞核中，其表達結果與P63表達結果相近。見圖1。3組ITGA6免疫組化表達結果見表2。ITGA6在CA組內表達最多，表達量明顯高于NS組，差異有統計學意義(P<0.01)。與NS組比較， CTX組ITGA6表達差異無統計學意義(P>0.05)。與CA組比較， CTX組ITGA6表達量減少，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3K10的表達 NS組K10主要表達于除表皮基底層以外的結構中，即棘層向外，表皮基底層表達為陰性；CA組表皮基底層K10表達為陰性，且基底層向上的結構中表達量較NS組少；CTX組K10表皮基底層同樣表達為陰性，但是在棘層、顆粒層及向外的結構中表達量較高。見圖1。3組K10免疫組化表達情況見表3。K10在NS組內表達最多，表達量明顯高于CA組和CTX組，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。與CA組比較，CTX組K10表達量增多，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖1 3組P63、ITGA6及K10免疫組化表達

表1 3組P63免疫組化表達情況

表2 3組ITGA6免疫組化表達情況

3 討論

CTX本身不具有藥理作用，經過肝細胞微粒體酶系統的轉換作用，產生結構類似于氮芥的活性代謝物而發揮作用[7-8]。本研究是在基于小劑量CTX治療CA的療法能使一部分CA患者疣體縮小，甚至消退現象的基礎上，進一步探尋疣體中與KCs的增殖與分化相關的分子事件。CA的組織病理顯示出不同程度的棘層肥厚，且棘層細胞出現明顯的空泡變性(挖空細胞)，同時有基底樣細胞增生，并伴有乳頭瘤樣增生。疣體KCs按分化程度的序列可分為表皮干細胞、短暫擴增細胞、分化細胞及終末分化細胞。由于細胞分化是一個逐漸完成的過程，致使表皮干細胞與短暫擴增細胞之間的界限不清，無論從細胞形態上，還是從干細胞的分子表達程度上，都無法辨別這兩類細胞。正常位于基底層及其上方的短暫擴增細胞其實是由表皮干細胞及其不同代的子代細胞，隨著擴增代數的增加，其干細胞性是一個逐漸喪失的過程，因而干細胞的標志物在KCs中的短暫擴增細胞群體中仍然存在，目前未明確絕對的表皮干細胞標記物，但可以肯定表皮干細胞存在于具有干細胞性的一群KCs中。這是本研究使用“KCs的干細胞性”這一名詞的理由。

表3 3組K10免疫組化表達情況

表皮干細胞注定是從增殖走向終末分化，轉錄因子P63既是干細胞標志物，也是增殖標志物，二者是一體兩面性。目前對于表皮干細胞標志物的研究，主要集中于整合素、轉錄因子P63以及角蛋白[9-12]。Mckeon及其團隊證實P63可以用于識別表皮中干細胞[9]，同時也有文獻證實ITGA6可以用作表皮干細胞標志物[13]。表皮干細胞的生物學使命就是從增殖走向終末分化。而對于分化成熟的KCs，已有多篇文獻使用K10作為其標志物[14-16]。因此，本文擬使用P63及ITGA6標志物用作表征疣體KCs的干細胞性，使用K10標志物用作表征KCs的終末分化程度。

就干細胞性而言，結果顯示在正常包皮組織KCs的P63及ITGA6主要表達于基底層，在未經小劑量CTX治療的對照組中，P63及ITGA6表達量均較正常包皮組織增多，而且表達部位不僅局限于基底層，在靠近基底層的棘層中也存在較多陽性表達。此結果說明CA組織中KCs的干細胞性存在增強的現象。而CTX組KCs的干細胞性明顯下降，陽性表達位置主要在基底層，而靠近基底層的棘層中僅有少量表達。該結果顯示小劑量CTX治療CA后存在KCs的干細胞性明顯下降現象。就KCs終末分化能力的影響而言，結果顯示正常包皮組織KCs的K10表達于基底層以上的表皮結構中，基底層表達為陰性；CA組K10表達量較NS組明顯減少，基底層不表達，在基底層上方的KCs中，仍可見較多陰性表達的細胞組織，該結果提示CA組織中KCs的終末分化受阻。CTX組KCs的K10表達量雖然沒達到正常組織水平，但有明顯增加現象，提示小劑量CTX療法可以促進疣體組織走向終末分化。

關于表皮干細胞相關標志物在尖銳濕疣組織內的表達的研究不少，大部分結果顯示表皮干細胞相關標志物在CA組織內表達增多[17-18]。依據上述結果，可以得知經“小劑量CTX療法”治療的CA患者，疣體中KCs的干細胞性下降，終末分化的能力增強，預示該療法能減少疣體中KCs的增殖，促進分化。

雖然上述結果為表象，但提示今后對該療法的有效性分子機制研究的方向，既可以聚焦到對疣體中KCs的干細胞性產生影響的具體分子機制，也可以聚焦到對疣體內KCs的終末分化的具體分子機制上。該療法有效機制的闡明為其臨床轉化提供理論基礎。

本研究的不足之處在于樣本數量偏小，需要進一步擴大樣本量進行研究，提供更充分的證據加以證實這一現象。