不同復合磷酸鹽添加量下牛肉糜理化特性研究

趙改名 孟子晴 祝超智 田 瑋 韓廣星 賈玉堂

(1.河南農業大學食品科學技術學院， 鄭州 450002； 2.河南農業大學牧醫工程學院， 鄭州 450002； 3.國家肉牛牦牛產業技術體系臨沂綜合試驗站， 臨沂 276000； 4.國家肉牛牦牛產業技術體系合肥綜合試驗站， 合肥 230031)

0 引言

近年來，隨著人民物質生活水平的提高和飲食結構的調整，風味獨特、營養豐富的牛肉制品愈發受到消費者喜愛[1]。在肉制品加工過程中，色澤、風味、質構等品質是主要評判指標，肉制品保持自身水分和外部水分的能力與肉的風味、色澤、質地等密切相關[2]。磷酸鹽具有與水結合、乳化、顏色穩定、抑制氧化、抗菌活性、蛋白質分散等特性，65%的加工肉制品中使用磷酸鹽，尤其是火腿、香腸、奶酪、魚罐頭和烘焙食品等[3]。以焦磷酸鈉(TSPP)、六偏磷酸鈉(SHMP)和三聚磷酸鈉(STPP)為代表的磷酸鹽在肉制品保水方面的研究備受關注，復配協同使用不同的磷酸鹽已成為熱點[2]。復合磷酸鹽對不同的原料肉產生的作用效果不同[4]，對肉制品質構特性[5]、脂肪氧化[6]等也會產生不同程度的影響。但是，過多的磷酸鹽會對骨骼和心血管產生負面影響，甚至增加腎臟的負擔[7]，因此出現了一些降低或者代替磷酸鹽作用功能的研究，如文獻[8]采用超高壓和添加低濃度復合磷酸鹽結合的方法調節雞肉凝膠的品質與保水效果。目前，復合磷酸鹽對肉制品保水作用的機理研究已較完善，但對牛肉制品的結構及流變特性的影響因素探究相對較少；復合磷酸鹽對香腸等肉糜產品的作用效果研究較多，但對未經斬拌只進行攪拌的有肉粒感的體系研究較少。探究復合磷酸鹽對牛肉糜的水分分布、結構及流變特性的影響，可為研究復合磷酸鹽對牛肉肉糜制品結構影響的作用機理提供理論依據，為尋找磷酸鹽同等功能代替物提供對比與參考。

本文選用由焦磷酸鹽、六偏磷酸鹽與三聚磷酸鹽以一定比例制備的復合磷酸鹽進行試驗，對未經斬拌、只進行攪拌的牛肉糜進行研究，通過對含水率、蒸煮損失、pH值、水分分布、微觀結構、蛋白質二級結構、流變特性等進行測定和分析，研究復合磷酸鹽對牛肉糜水分分布、結構及流變特性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛霖肉、食鹽、黑胡椒粉等原輔料均購于鄭州市丹尼斯花園路店拜特超市；復合磷酸鹽，河南恩苗食品有限公司；煙酰胺，萬邦實業有限公司；抗壞血酸鈉，河南九庭化工產品有限公司。

1.2 儀器設備

MM12B型絞肉機，廣東省韶關市大金食品機械廠；BLKJ-20型攪拌擂潰機，嘉興艾博實業有限公司；KA-4800型上豪電烤箱，東莞市龍牌實業有限公司；ALLEGRA-64A型高速冷凍離心機，鄭州美聲商貿有限公司；BPG-9156A型精密鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；BC/BD-317HEF型電冰箱，青島海爾電冰柜有限公司；AL104型電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；PQ001 MicroMR型柜式NMR成像儀，上海紐邁電子科技有限公司；S-3400N型掃描電鏡，日本日立公司；TENSOR-Ⅱ型傅里葉紅外光譜儀，布魯克科技有限公司；DHR-1型旋轉流變儀，美國TA儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1樣品制備

挑選符合國家衛生標準的冷鮮牛霖肉，除筋膜、浸泡沖洗、切塊，通過直徑10 mm篩孔的絞肉機絞碎。添加食鹽、抗壞血酸鈉、煙酰胺、嫩肉粉分別為2.00%、0.12%、0.02%、0.80%(以占牛肉的質量分數計)，然后分別添加復合磷酸鹽0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，并設置空白對照組，充分混勻后4℃腌制1 h，然后放入攪拌擂潰機中，攪拌2 min，肉糜制作完成，儲存于4℃。用模具使牛肉糜成型后制作牛肉糜餅，-30℃冷凍儲存。測試熟肉糜餅樣品時，在電烤箱中200℃加熱10 min(每5 min翻面一次)進行熱處理。

1.3.2含水率和pH值測定

含水率測定參考GB/T 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》[9]；pH值測定參考GB/T 5009.23—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》[10]。

1.3.3牛肉糜蒸煮損失測定

參照文獻[11]的方法，略作修改：將一定質量的生肉糜放入離心管中于5 000 r/min轉速下離心5 min，70℃水浴加熱30 min；取出離心管，倒放在干燥瓶靜置2 h，再稱蒸煮后的樣品質量。樣品蒸煮后減少的質量與樣品質量的百分比計為蒸煮損失率。

1.3.4自旋-自旋弛豫時間T2測定

參照文獻[12]的方法略作修改：在32℃下，稱量大約2 g樣品放入直徑15 mm的核磁管中，將其放入PQ001 MicroMR型柜式NMR成像儀，用CPMG(自旋回波)序列進行測量；使用參數為：共振頻率22 MHz，半回波時間為250 μs，重復掃描32次。每組測試4個重復。

1.3.5微觀結構觀察

參照文獻[13]的方法稍加改動，具體方法如下：從熱處理后的熟肉餅中取1 cm×1 cm×1 cm方塊樣品放置于含有2.5%戊二醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液中固定48 h后切成1 mm薄片，然后用磷酸緩沖液(pH值7.3)浸泡10 min，再漂洗3次，然后用乙醇梯度脫水，每個濃度脫水30 min，然后用丙酮梯度脫水，每個濃度脫水20 min，50℃干燥箱中加熱15～20 min至干燥，然后噴金、觀察并拍照。

1.3.6蛋白質二級結構測定

參照文獻[14]的方法，略作修改。將樣品冷凍干燥、磨粉、過100目篩，采用布魯克科技有限公司TENSOR-Ⅱ型傅里葉紅外光譜儀測定牛肉糜與牛肉糜餅二級結構。參數設置：掃描范圍400～4 000 cm-1，掃描32次，分辨率4 cm-1。對測試結果中酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)去卷積、基線校正及二階求導，然后進行曲線擬合。

1.3.7流變特性的測定

參照文獻[15]的方法，略作修改。通過美國TA儀器有限公司生產的DHR-1型旋轉流變儀測定，將樣品涂抹均勻，不要有氣泡，然后用硅油液封邊緣。參數設置：平板直徑為40 mm，夾具間隙為1 mm，應變1%，20℃保溫5 min，溫度梯度為20～80℃，升溫時間為5℃/min。

1.4 數據處理與統計分析

數據采用SPSS(IBM 16.0)分析，Oringin 8.5繪圖，多重比較誤差使用Duncan法表示，數據表達方式為平均值±標準差，p<0.05為顯著水平。

2 結果與分析

2.1 牛肉糜含水率、蒸煮損失率和pH值

如圖1(圖中不同字母表示差異顯著，下同)所示，隨著復合磷酸鹽添加量的增加，牛肉糜的含水率先增加然后保持波動穩定，0.2%添加量時比空白對照組增加了5.87個百分點。如圖2所示，隨著復合磷酸鹽添加量的增加，蒸煮損失率呈持續下降趨勢(p<0.05)，在添加量為0.5%時降低到了6.89%，與空白組的15.47%相比蒸煮損失率減少了8.58個百分點，說明復合磷酸鹽能有效改善牛肉糜的保水性，與文獻[16]研究磷酸鹽對豬肉糜保水作用影響的結果一致。0.2%時牛肉糜蒸煮損失率最低，與0.5%添加量時牛肉糜蒸煮損失率無顯著性差異。

圖1 復合磷酸鹽添加量對牛肉糜含水率的影響Fig.1 Effect of compound phosphate on moisture content of beef minced meat

圖2 復合磷酸鹽添加量對牛肉糜蒸煮損失率的影響Fig.2 Effect of compound phosphate on cooking loss rate of beef minced meat

如圖3所示，隨著復合磷酸鹽添加量的增加，牛肉肉糜的pH值從5.7上升到6.4，但是在添加0.2%之后pH值變化緩慢，與蒸煮損失變化基本一致。pH值的增加導致蛋白質之間的靜電排斥力增加，從而更加緊密地結合水分[17]，使肌肉纖維膨脹、蛋白質活化，水與肉的結合更加穩定。有研究指出，復合磷酸鹽主要是通過提高肉的pH值、螯合肉中的金屬離子、增加肉的離子強度、解離肌動球蛋白這4種作用來提高肉制品的保水性[7]。增加復合磷酸鹽使pH值升高，導致肌原纖維蛋白質偏離等電點，凈負電荷增加，蛋白質與水的相互作用加強，蛋白質與蛋白質的相互作用減弱，蛋白質溶解度提高，提取更充分，保水性更高[3]。

圖3 復合磷酸鹽添加量對牛肉糜pH值的影響Fig.3 Effect of compound phosphate on pH value of beef minced meat

2.2 牛肉糜水分遷移

橫向弛豫時間T2可以表征肉類結構中的保水性，并且弛豫時間T2越小，水分與底物結合越緊密，產品與水之間的結合程度越強[18]。T21、T22、T23分別表示結合水、不易流動水、自由水的橫向弛豫時間。不易流動水(纖絲、肌原纖維及膜之間)被認為與產品的保水性最為密切，不易流動水T22的積分面積越大，說明截留的水分越多，保水性越好[19]。

如圖4(圖中不同字母表示同一弛豫時間、不同復合磷酸鹽添加量下差異顯著)所示，復合磷酸鹽的添加可以縮短T21、T22，說明隨著復合磷酸鹽添加量的增加，對水的束縛能力增強，肉糜的持水能力增加。這可能是因為復合磷酸鹽中的三聚磷酸鹽、焦磷酸鹽可以改變蛋白質電荷的電勢進而提高體系的離子強度，使其偏離等電點，電荷之間相互排斥，導致蛋白質之間生成更大的空間，使肉組織可包容更多水分，即復合磷酸鹽使蛋白質膨潤導致保水性提高；另一方面，六偏磷酸鹽能螯合金屬離子，減少金屬離子與水的結合，使蛋白質結合更多水分而提高保水性。文獻[20]對豬肉糜進行試驗時也證明了豬肉糜的橫向弛豫時間會因磷酸鹽的添加而縮短，不易流動水的流動性降低。添加量為0.2%時不易流動水峰面積最大，但添加量超過0.2%之后不易流動水的峰面積減小，即不易流動水含量減少，說明復合磷酸鹽添加量為0.2%時保水效果最好。

圖4 復合磷酸鹽添加量對牛肉糜水分遷移的影響Fig.4 Effect of compound phosphates on water migration of beef minced meat

2.3 牛肉糜微觀結構

圖5所示的整個結構是以蛋白質為骨架形成的連續的網絡結構，蛋白網絡孔洞是脫水脫脂后形成的空洞[15]。從微觀結構可以看出，復合磷酸鹽添加量較少(0.1%～0.2%)時，孔洞較少，但單個孔洞的直徑較大，基本在20～50 μm之間。隨著復合磷酸鹽添加量的增加，牛肉糜形成的網狀結構逐漸致密、均一，孔洞逐漸均勻、細小，孔洞直徑基本在25 μm以下。試驗表明，復合磷酸鹽提高了pH值，通過水合作用使保水性提高，同時解離肌動球蛋白為肌球蛋白和肌動蛋白，蛋白質分子結合水分而提高保水性。另外，隨著添加量的增加，形成孔洞越來越致密，深度加深，說明形成了細致的凝膠網絡，產生了大量的微小孔洞均勻分布在凝膠網絡中，借助毛細管力的作用保持部分水分。

2.4 牛肉糜蛋白質二級結構

如表1所示，復合磷酸鹽添加量改變了生牛肉肉糜β-轉角的相對含量(p<0.05)，在α-螺旋、β-折疊、無規則卷曲方面無顯著性差異(p>0.05)。β-轉角的相對含量從空白對照組的(27.73±0.44)%增加到(30.23±0.75)%，說明復合磷酸鹽增多使得牛肉肉糜體系趨向不穩定的方向。

熱誘導凝膠形成之后的牛肉糜，隨著復合磷酸鹽添加量的增加，α-螺旋相對含量由34.34%逐漸降至26.76%、β-轉角相對含量由17.41%逐漸增加至29.41%。α-螺旋、β-折疊的相對含量表征穩定性較好的有序蛋白二級結構，β-轉角和無規則卷曲相對含量表征無序結構，這表明復合磷酸鹽增多使得牛肉糜體系趨向不穩定的方向，添加量為0.5%時，結構最為疏松無序。與文獻[21]研究焦磷酸鹽對草魚肌原纖維蛋白結構影響時得到α-螺旋相對含量降低、β-轉角含量升高結果一致。這可能是因為隨著復合磷酸鹽添加量的增加，肌原纖維蛋白的溶解性加大，導致蛋白質之間的距離增大，分子鏈伸展，使肌球蛋白尾部的α-螺旋鏈部分解開，同時加強了維持二級結構穩定的作用力，使得肌原纖維蛋白α-螺旋向β-折疊和β-轉角轉化，蛋白結構更為伸長[22]。

熱處理后牛肉糜形成熱誘導凝膠與熱處理前的肉糜相比α-螺旋、β-折疊相對含量上升，β-轉角相對含量下降，無規則卷曲基本保持不變，這是因為在肉制品的加工過程中，熱處理會破壞肌肉蛋白質的天然構象，蛋白質發生變性聚集交聯，形成具有三維網絡結構的凝膠。

2.5 牛肉糜流變特性

肌原纖維蛋白受熱凝膠化是一個伴隨著蛋白解鏈、變性和凝聚等物化反應的不穩定動態流變過程[23]。動態流變主要是在小幅振蕩中施加應力，通過樣品對此應力反饋出的G′(儲能模量)、G″(損耗模量) 等特征指標來反映凝膠的黏彈性質[24]。在動力學加熱過程中G′和G″及損耗角正切值tanδ的變化可表明肌球蛋白相互聚集速率的變化，反映不同時期蛋白結構的變化情況[25]。

圖5 復合磷酸鹽添加量對牛肉糜微觀結構的影響Fig.5 Effect of compound phosphate on microstructure of beef minced meat

表1 不同復合磷酸鹽添加量下生牛肉糜、熱處理后牛肉糜的蛋白質二級結構相對含量Tab.1 Effect of compound phosphate on relative content of protein secondary structure in raw beef minced meat and beef minced meat after heat treatment%

G′表征彈性特征，值越大代表彈性能力越好。如圖6a所示，復合磷酸鹽降低了牛肉糜的儲能模量，但基本變化趨勢不改變，這與蛋白質二級結構和微觀結構觀察得到結果一致，說明了復合磷酸鹽降低了凝膠效果；G″表征凝膠體系的黏性特征，如圖6b所示，添加復合磷酸鹽降低了損耗模量，即降低了初始流動所需的能量。損耗角正切值等于損耗模量與儲能模量的比值各組正切值，表征的是凝膠的總體黏彈性特征，正切值越小，樣品流動性越差。

圖6c中不同處理牛肉糜的損耗角正切值tanδ表明，復合磷酸鹽添加量會影響肉糜蛋白體系在加熱過程中的相轉變過程以及肉糜的黏彈特性，整體來看均小于1，說明樣品顯黏性流體性質。其中，復合磷酸鹽添加量為0.2%處理組的tanδ在升溫過程中變化最為劇烈。在20℃時復合磷酸鹽添加量為0.2%牛肉糜處理組的損耗角正切值顯著小于其他各組，樣品的流動性最差。50～57℃的升高可能是由于肌肉蛋白的α-螺旋結構在這期間遭到大量破壞，轉變成為結構松散的β-折疊，從而導致流動性的上升，但是與文獻[26]等得到的兔肌球蛋白損耗角正切值在45～47℃時略微升高有所差異，這可能是因為原料肉不同，牛肌肉蛋白較兔肉更為穩定，對熱的抵抗性更強，需要更高的溫度α-螺旋才被大量破壞。有研究表明，結構轉變的溫度范圍取決于蛋白質系統中的物種、pH值、離子強度、成分等因素[16]。

圖6 復合磷酸鹽添加量對牛肉糜流變特性的影響Fig.6 Effect of compound phosphates on rheological properties of beef minced meat

3 結論

(1)添加復合磷酸鹽使肉糜體系對結合水、不易流動水的束縛能力顯著提升，在0.2%添加量時牛肉糜蒸煮損失率最低，不易流動水峰面積最大。

(2)復合磷酸鹽添加量的增加，改變了熱誘導凝膠體系的結構，使熱處理后牛肉糜蛋白質二級結構α-螺旋、β-折疊相對含量顯著減小，顯出更加松散無序的狀態，使得微觀結構中的孔洞更加密集、均勻，孔洞直徑更小，添加量為0.5%時，結構最為疏松。

(3)綜合考慮，復合磷酸鹽添加量為0.2%時，其水分分布狀態趨于穩定，良好的水分分布促使蛋白網絡充分形成，并對粘彈性產生有利影響，說明0.2%添加量是牛肉糜的較優添加量。