基于核酸適配體的牛奶和雞蛋中雌二醇納米金比色檢測(cè)

王 欣 孫涵穎

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院， 上海 200093)

0 引言

雌二醇(17β-estradiol，E2)是一種具有較強(qiáng)生物活性的雌激素。近年來(lái)，一些養(yǎng)殖戶為了加快畜、禽的生長(zhǎng)和繁殖而頻繁使用雌激素。雌二醇化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在動(dòng)物體內(nèi)沒(méi)有特定的代謝系統(tǒng)，極易在畜、禽體內(nèi)滯留，進(jìn)而通過(guò)食物鏈擾亂人體及動(dòng)物的正常生理功能，影響人體健康。因此，加強(qiáng)對(duì)可食性畜、禽產(chǎn)品中的E2殘留水平的監(jiān)測(cè)是保障食品安全的重要措施之一[1]。

傳統(tǒng)的色譜技術(shù)可對(duì)雌二醇進(jìn)行檢測(cè)，如高效液相色譜法[2-3]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[4-5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法[6]等。但這些方法存在操作復(fù)雜、成本高、檢測(cè)結(jié)果易受干擾等問(wèn)題。因此，有必要探索一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的雌激素靶向檢測(cè)技術(shù)和方法，以便對(duì)可食性畜、禽產(chǎn)品中的E2殘留水平進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

核酸適配體能與靶標(biāo)發(fā)生類似抗原-抗體反應(yīng)，且比抗體和酶具有更好的選擇性、親和力及穩(wěn)定性，故而在各類高效、快速生物傳感器的構(gòu)建中發(fā)揮了重要作用[7]。其中，核酸適配體與納米金(AuNPs)粒子相結(jié)合形成的比色分析技術(shù)具有結(jié)果穩(wěn)定可靠、操作簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、靶向性強(qiáng)的特點(diǎn)。目前，基于核酸適配體的納米金比色傳感分析技術(shù)可用于檢測(cè)食品中的金屬離子[8]、生物毒素[9]和小分子[10]等污染因子。目前研究大多基于文獻(xiàn)[11]首次篩選得到的長(zhǎng)度為76 mer的E2的核酸適配體進(jìn)行。文獻(xiàn)[12]設(shè)計(jì)了E2的核酸適配體比色傳感器，可對(duì)河水中的E2進(jìn)行快速分析，但檢測(cè)限較高，為36.7 nmol/L。文獻(xiàn)[13]基于相同的適配體設(shè)計(jì)了針對(duì)尿液和唾液中E2檢測(cè)的核酸適配體納米金比色傳感器，其靈敏度較高，檢測(cè)限為0.2 nmol/L。文獻(xiàn)[10]比較了3種長(zhǎng)度的適配體(75、35、22 mer)對(duì)比色傳感器檢測(cè)E2效果的影響，認(rèn)為長(zhǎng)度為35 mer的適配體對(duì)牛乳中E2的檢測(cè)具有較好效果。文獻(xiàn)[14]應(yīng)用35 mer的適配體設(shè)計(jì)了比色傳感器，可對(duì)尿液中E2進(jìn)行有效檢測(cè)，檢測(cè)限為0.2 nmol/L。針對(duì)食品體系中E2的基于核酸適配體的納米金比色檢測(cè)技術(shù)仍需進(jìn)一步研究，以明確該方法適宜的檢測(cè)條件和對(duì)不同食品的適用性及穩(wěn)定性。

本文以牛奶和雞蛋作為典型的研究對(duì)象，以建立簡(jiǎn)單、靈敏的雌二醇快速分析技術(shù)為目標(biāo)，以納米金比色分析為基礎(chǔ)，以雌二醇特異性適配體為傳感探針，對(duì)各試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，提出基于核酸適配體的雌二醇納米金比色傳感分析技術(shù)和方法，并分析對(duì)牛奶和雞蛋中雌二醇檢測(cè)的可行性，以期為動(dòng)物食品樣品中雌二醇的快速檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-9100 D型紫外可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)；JEOL2100F型透射電鏡(日本電子株式會(huì)社)；173plus型動(dòng)態(tài)光散射儀(美國(guó)Brookhaven公司)；PWC254型分析天平(武漢艾德姆衡器有限公司)；SynergyH4型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)biotek公司)；KQ-50DE型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；渦旋混合器(德國(guó)IKA公司)。雌二醇適配體(5′-GCTTCCAGC TTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCG-CATTCAATTGCTGCGCGCTG-AAGCGCGGAAGC-3′)由上海生工公司合成[11]。檸檬酸(99.5%)、氯金酸(48%～50%)、二水合檸檬酸鈉等(99%)、雌二醇(98%)、雙酚A(>99%)、甲基睪酮(98%)、己烯雌分(99%)、黃體酮(99%)、甲醇，購(gòu)自麥克林試劑有限公司(上海)。純牛奶、雞蛋樣品購(gòu)于本地超市。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1納米金粒子的合成與表征

在文獻(xiàn)[15]的基礎(chǔ)上修改，在燒杯中準(zhǔn)確加入25 mL去離子水，110℃恒溫水浴攪拌條件下準(zhǔn)確加入350 μL 20 mmol/L的氯金酸溶液及300 μL 100 mmol/L 二水合檸檬酸鈉，繼續(xù)攪拌15 min直至溶液變紅，表明生成納米金粒子(AuNPs)，冷卻至室溫(20℃)，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

利用透射電子顯微鏡觀察AuNPs的形貌。具體步驟如下：將AuNPs分散液滴在覆有碳膜的銅網(wǎng)上，自然干燥后觀察樣品的微觀形貌，測(cè)試加速電壓為200 kV，選取代表性部位進(jìn)行拍照分析。

采用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)量AuNPs的平均水合動(dòng)力學(xué)直徑及多分散系數(shù)。具體步驟如下:將AuNPs分散于去離子水中，超聲分散3 min后，進(jìn)行2倍稀釋，在100 μL樣品皿中準(zhǔn)確加入65 μL分散液樣品，在25℃、折光率為0.331、pH值為7的條件下進(jìn)行檢測(cè)。以水在25℃的粘度和折射系數(shù)為參照，散射光以90°的固定角度進(jìn)行采集，掃描15次，直接讀取并記錄儀器測(cè)得的平均水合動(dòng)力學(xué)直徑和多分散系數(shù)，導(dǎo)出散射光強(qiáng)度原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，繪制粒徑分布曲線。

用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量AuNPs溶液在400～700 nm的吸收光譜。將AuNPs分散于離子水中，超聲分散3 min后，進(jìn)行1倍稀釋，在100 μL光程為1 cm的比色皿中準(zhǔn)確加入65 μL分散液樣品，在波長(zhǎng)400～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收曲線掃描，根據(jù)朗伯比爾定律計(jì)算AuNPs的濃度，公式為

A=εbc

(1)

式中A——吸光度ε——摩爾吸光系數(shù)

b——光程，取1 cm

c——AuNPs的濃度

1.2.2反應(yīng)條件的優(yōu)化

(1)適配體和NaCl濃度

適配體原液：開蓋前先將E2適配體離心(4 000 r/min，30～60 s)，再開蓋加入100 μL去離子水，充分振蕩混勻,得到100 μmol/L的適配體原液，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

適配體溶液:以適配體原液進(jìn)行一定程度的稀釋,使適配體濃度分別為0.825、1.24、1.65、2.06 μmol/L。

反應(yīng)過(guò)程：向含有100 μL 0.15 nmol/L的AuNPs溶液的離心管中準(zhǔn)確移加100 μL不同濃度的適配體溶液，使檢測(cè)體系中AuNPs與適配體的濃度比分別為1∶5 500、1∶8 250、1∶11 000、1∶13 750,渦旋振蕩15 s，室溫孵育30 min后，再向體系中分別加入1.25、2.5、3.75、5、6.25、7.5 μL 1 mol/L的NaCl溶液，使體系中NaCl濃度分別為6、12、18、24、30、36 mmol/L，渦旋振蕩15 s，孵育5 min，觀察體系的顏色變化，并用酶標(biāo)儀測(cè)量其在400～800 nm的吸收光譜，計(jì)算A650/A530(A650、A530分別表示650、530 nm處的吸光度)及其變化量。分別以AuNPs溶液和不添加NaCl的體系為對(duì)照。

(2)適配體與AuNPs孵育時(shí)間

向含有100 μL 1.65 μmol/L 適配體原液的離心管中準(zhǔn)確加入100 μL 0.15 nmol/L AuNPs溶液，使體系中AuNPs與適配體濃度比為1∶11 000，渦旋振蕩15 s，室溫下分別孵育0、15、30、45、60 min后，加入5 μL 1 mol/L的NaCl溶液，使體系中NaCl濃度為24 mmol/L。渦旋振蕩15 s后，孵育5 min。觀察體系的顏色變化，并用酶標(biāo)儀測(cè)量其在400～800 nm的吸收光譜，計(jì)算A650/A530。

1.2.3檢測(cè)方法的性能分析

(1)工作曲線

E2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.6 g E2，置于燒杯中，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)99.99%的甲醇，25℃水浴超聲處理30 min，使其充分溶解至澄清，再定容至100 mL，即得0.022 mol/L的E2標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

E2工作溶液：將E2標(biāo)準(zhǔn)溶液倍比稀釋配制濃度為5.4、6.5、7.6、8.7、9.7、10.8、12、15.2 nmol/L的E2工作溶液。

向含有100 μL 1.65 μmol/L 適配體原液的離心管中準(zhǔn)確加入100 μL 0.15 nmol/L AuNPs溶液，使體系中AuNPs與適配體濃度比為1∶11 000，渦旋振蕩15 s，室溫孵育30 min后，再加入5 μL 1 mol/L的NaCl溶液，使體系中NaCl濃度為24 mmol/L，渦旋振蕩15 s，孵育5 min后，向反應(yīng)體系中分別移加10 μL不同濃度的E2溶液，使體系中E2濃度分別為0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6 nmol/L。室溫下反應(yīng)5 min，觀察體系的顏色變化，并用酶標(biāo)儀測(cè)量其在400～800 nm的吸收光譜，計(jì)算A650/A530，以E2濃度為橫坐標(biāo)，以A650/A530為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。

(2)方法的靈敏度

在確定檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，向檢測(cè)體系中加入10 μL去離子水作為空白樣品進(jìn)行分析，用酶標(biāo)儀分別測(cè)定20個(gè)空白樣品在400～800 nm的吸收光譜，計(jì)算A650/A530及其標(biāo)準(zhǔn)偏差，方法檢出限(Limitation of detection，LOD)[16]計(jì)算公式為

LOD=SNSD/SL

(2)

式中SN——信噪比，取3

SD——標(biāo)準(zhǔn)偏差

SL——線性斜率

(3)方法的特異性

參照上述E2工作溶液的配制方法，配制濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 nmol/L的甲基睪酮、己烯雌酚、雙酚A和黃體酮溶液。用建立的方法對(duì)其進(jìn)行分析，用酶標(biāo)儀測(cè)量其在400～800 nm的吸收光譜，計(jì)算A650/A530。

1.3 樣品的檢測(cè)

以牛奶、雞蛋為實(shí)際檢測(cè)樣品，參照文獻(xiàn)[17-18]的方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理。先將蛋清與水以體積比為 2∶1進(jìn)行稀釋，獲得蛋清溶液，使牛奶體系中E2的濃度為0.5～0.9 nmol/L，蛋清溶液體系中E2的濃度為0.3～1.0 nmol/L。取4 mL牛奶或蛋清溶液于燒杯中，再加入2 mL 10%三氯乙酸和2 mL氯仿，渦旋振蕩1 min，超聲15 min后，以13 000 r/min離心10 min，取上清液，再以10 000 r/min離心3 min，取上清液，按照1.2.3節(jié)的方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)量其在400～800 nm的吸收光譜，計(jì)算A650/A530，繪制工作曲線，計(jì)算LOD。

加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)：在牛奶和雞蛋樣液中分別加入一定體積的E2標(biāo)準(zhǔn)溶液，使牛奶體系中E2的濃度分別為0.5、0.6、0.7 nmol/L，雞蛋樣液中E2的濃度分別為0.3、0.6、0.9 nmol/L，每個(gè)添加水平平行檢測(cè)5次， 計(jì)算回收濃度、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)均設(shè)置3次平行，3次重復(fù)。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(ANOVA)比較不同影響因素對(duì)A650/A530的影響。p<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Origin 8軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)原理

比色傳感器由于其簡(jiǎn)單、高靈敏度而受到廣泛關(guān)注。AuNPs由于具有極高的消光系數(shù)和很強(qiáng)的粒子間光距效應(yīng)，是一種非常敏感的比色指示劑[19]，因此可利用AuNPs這種光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行靶分子的定量分析[20]。基于核酸適配體的納米金比色法檢測(cè)E2的原理如圖1所示。

圖1 基于核酸適配體的納米金比色法檢測(cè)E2的原理示意圖Fig.1 Schematic of gold nanoparticles colorimetry assay for rapid determination of 17β-estradiol based on aptamer

一般情況下，AuNPs粒子表面呈負(fù)電性的檸檬酸鹽離子通過(guò)靜電斥力使體系穩(wěn)定分散，當(dāng)溶液中

存在NaCl時(shí)，AuNPs表面的負(fù)電荷被溶液中的陽(yáng)離子中和，導(dǎo)致AuNPs之間的靜電作用力減小而引起聚集，溶液顏色相應(yīng)地發(fā)生改變[13]。當(dāng)核酸適配體通過(guò)靜電作用吸附在AuNPs的表面時(shí)，可以增強(qiáng)AuNPs在NaCl中的穩(wěn)定性，使AuNPs粒子在高鹽濃度下呈游離狀態(tài)[21-22]。加入目標(biāo)物后，由于目標(biāo)物與核酸適配體之間具有更強(qiáng)的親和力，故核酸適配體從AuNPs表面脫落，導(dǎo)致AuNPs在NaCl的作用下發(fā)生聚集，溶液顏色發(fā)生變化。AuNPs的顏色變化與其最大吸收峰也緊密相關(guān)，隨粒徑增大，其最大吸收峰波長(zhǎng)增大，一般可用530 nm和650 nm處的吸收峰代表游離和聚集的AuNPs的相對(duì)數(shù)量，基于此，可通過(guò)分析A650/A530隨目標(biāo)物濃度的變化規(guī)律，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)對(duì)體系中目標(biāo)物(E2)的檢測(cè)。

2.2 AuNPs粒子的制備與表征

由圖2a的透射電鏡結(jié)果可知，所合成的AuNPs顆粒的直徑約為40 nm，分散狀態(tài)較好。紫光吸收光譜結(jié)果(圖2b)表明，AuNPs體系在波長(zhǎng)530 nm左右處有明顯的金的吸收峰，吸光度為0.51，已知AuNPs摩爾吸光系數(shù)ε=6.7×109L/(cm·mol)[23],應(yīng)用朗伯比爾定律計(jì)算可知AuNPs的濃度為0.15 nmol/L。動(dòng)態(tài)光散射可以測(cè)量AuNPs的水合粒徑(圖2c)，反映AuNPs的聚集情況[24]。AuNPs的平均粒徑為44.44 nm，大部分粒子處于分散狀態(tài)，說(shuō)明AuNPs粒子的分散性良好，AuNPs 的粒徑分布較均勻，可用于比色傳感器的構(gòu)建。

圖2 AuNPs的表征 Fig.2 Characterization of AuNPs

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1適配體濃度和NaCl濃度

由于本方法是基于E2和AuNPs競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合適配體的原理來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)E2的檢測(cè)，因此，適配體濃度、NaCl濃度與方法的穩(wěn)定性、靈敏度及檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性密切相關(guān)[25]。

一般情況下，當(dāng)AuNPs發(fā)生聚集時(shí)，其在530 nm左右處的吸收峰強(qiáng)度將相對(duì)降低，而由于聚集體表面等離子體共振峰發(fā)生了紅移，將在650 nm左右處出現(xiàn)新的吸收峰[26]。圖3a對(duì)AuNPs、AuNPs+ NaCl(24 mmol/L)、AuNPs+Apt(1∶11 000)及AuNPs+ Apt(1∶11 000) + NaCl(24 mmol/L)4種體系的吸收光譜進(jìn)行了對(duì)比。

圖3 適配體及NaCl對(duì)體系的紫外可見吸收光譜、顏色及ΔA650/A530的影響Fig.3 Effects of aptamer and NaCl on UV-visible absorption spectra,colors and ΔA650/A530 of system

圖3a表明，當(dāng)在AuNPs體系中加入NaCl(24 mmol/L)時(shí)，體系在530 nm處的吸收峰顯著下降，且在650 nm左右出現(xiàn)了明顯的吸收峰。溶液顏色由酒紅色變?yōu)樗{(lán)灰色，說(shuō)明AuNPs發(fā)生了明顯的聚集。與AuNPs+Apt組(Apt是指雌二醇的適配體)相比，AuNPs+Apt+NaCl試驗(yàn)組在530 nm處的吸光度變化不明顯，溶液顏色仍為酒紅色，這說(shuō)明通過(guò)靜電作用吸附于AuNPs表面的適配體增強(qiáng)了粒子的穩(wěn)定性，阻止鹽誘導(dǎo)的AuNPs聚集，使AuNPs維持了游離狀態(tài)。

將不同適配體濃度及離子強(qiáng)度下AuNPs體系的A650/A530結(jié)果列于表1。由表1可知，當(dāng)體系中NaCl濃度為零時(shí)，在AuNPs與適配體濃度比為1∶0、

1∶5 500、1∶8 250和1∶11 000時(shí)，體系的A650/A530無(wú)顯著區(qū)分，表明AuNPs呈良好的分散狀態(tài)；而當(dāng)AuNPs與適配體濃度比為1∶13 750時(shí)，體系的A650/A530顯著高于其他系列，說(shuō)明此時(shí)體系中的AuNPs發(fā)生了一定程度的團(tuán)聚。總體來(lái)看，隨體系中NaCl濃度的增加，各體系的A650/A530均相對(duì)增大，其中未加以適配體保護(hù)的系列，即AuNPs與適配體濃度比為1∶0時(shí)，體系的A650/A530變化最為顯著，在NaCl濃度為6 mmol/L時(shí)，體系的A650/A530已顯著增大至0.878±0.013，且在NaCl濃度為24 mmol/L時(shí)，體系的A650/A530則進(jìn)一步增大至1.000±0.015。比較AuNPs與適配體濃度比為1∶5 500、1∶8 250及1∶11 000的3個(gè)體系的A650/A530，可以發(fā)現(xiàn)1∶11 000系列對(duì)AuNPs有較好的保護(hù)作用，在NaCl濃度為24 mmol/L時(shí)，其A650/A530為0.804±0.002，顯著低于其他適配體濃度的系列，說(shuō)明此體系條件下，有利于保持AuNPs相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。

AuNPs與加入不同比例適配體和不同濃度NaCl體系的A650/A530差值記為體系的ΔA650/A530。ΔA650/A530越大，說(shuō)明AuNPs的聚集程度越大。反之，則AuNPs的聚集程度越小。圖3c為不同適配體及NaCl濃度下體系的ΔA650/A530變化情況。

由圖3c可知，不同的適配體濃度下，體系的ΔA650/A530有所區(qū)別。例如，當(dāng)AuNPs與適配體濃度比為1∶13 750，NaCl濃度為零時(shí)，ΔA650/A530為0.098，說(shuō)明此時(shí)AuNPs已發(fā)生了一定程度的聚集，這與表1中A650/A530的變化相符。相比之下，在體系含有一定濃度的NaCl時(shí)，各AuNPs-Apt體系的ΔA650/A530均為負(fù)值，證明適配體的引入有效增強(qiáng)了AuNPs體系的穩(wěn)定性。其中，當(dāng)AuNPs與適配體濃度比為1∶11 000時(shí)， 在不同的NaCl濃度下體系的ΔA650/A530均相對(duì)較小，當(dāng)NaCl濃度為24 mmol/L時(shí)，ΔA650/A530為-0.196，說(shuō)明體系整體具有較好的穩(wěn)定性，AuNPs-Apt粒子呈良好的分散狀態(tài)。綜上分析，可選擇AuNPs與適配體濃度比為1∶11 000、NaCl濃度為24 mmol/L進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)條件的優(yōu)化。

表1 不同適配體濃度及離子強(qiáng)度下AuNPs體系的A650/A530Tab.1 A650/A530 of AuNPs under different aptamer concentrations and ionic strength

2.3.2孵育時(shí)間

AuNPs與適配體孵育時(shí)間會(huì)影響AuNPs-Apt聚合物的形成程度[27]。將AuNPs與適配體孵育室溫孵育0～60 min后，在NaCl濃度為24 mmol/L的條件下檢測(cè)各體系的吸收光譜(圖4a)并分析A650/A530的變化(圖4b，圖中不同字母表示差異顯著)。由圖4a可知，當(dāng)孵育0 min時(shí)，AuNPs在530 nm處的原始吸光度降低，而在650 nm處出現(xiàn)明顯的吸收峰，相應(yīng)地，圖4b中該體系的A650/A530最高，為1.06，說(shuō)明不經(jīng)孵育，適配體難以通過(guò)靜電作用有效吸附于AuNPs表面，無(wú)法維持AuNPs粒子的穩(wěn)定性，造成AuNPs在NaCl的作用下發(fā)生粒子的聚集。隨著AuNPs與適配體孵育時(shí)間延長(zhǎng)至15 min，體系的A650顯著降低，A650/A530相對(duì)減小，表明隨著適配體在AuNPs表面的吸附，其對(duì)AuNPs的保護(hù)作用增強(qiáng)，使AuNPs呈良好分散狀態(tài)。其中，孵育30 min，體系的A650/A530較小，為0.80，說(shuō)明孵育30 min可使適配體充分吸附于AuNPs表面，從而起到保護(hù)AuNPs的作用。因此，選擇AuNPs與適配體孵育時(shí)間為30 min。

圖4 AuNPs與適配體孵育時(shí)間對(duì)體系的紫外可見吸收光譜及A650/A530的影響Fig.4 Effects of incubation time of AuNPs and aptamer on UV-visible absorption spectra and A650/A530 of system

2.4 靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線

為評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法對(duì)目標(biāo)物(E2)的響應(yīng)度，在以上確定的檢測(cè)條件下，對(duì)濃度0.25～0.60 nmol/L E2體系進(jìn)行分析，各體系的吸收光譜及A650/A530的變化如圖5所示。

圖5 E2濃度對(duì)AuNPs-Apt體系紫外可見吸收光譜及A650/A530的影響Fig.5 Effects of E2 concentration on UV-visible absorption spectrum and A650/A530 of system

由圖5a可知，隨著體系中E2濃度的增大，其在650 nm出現(xiàn)吸收峰，肉眼觀察可見溶液顏色逐漸加深，由紅色變?yōu)樽仙笞兯{(lán)，當(dāng)E2濃度大于0.50 nmol/L時(shí)，溶液顏色變化肉眼可見。圖5b中的A650/A530相應(yīng)增大，當(dāng)E2濃度為0.25～0.60 nmol/L時(shí)，體系的A650/A530與E2濃度間呈良好線性相關(guān) (R2=0.915)。進(jìn)而計(jì)算可得到該方法的檢測(cè)限(LOD)為0.233 nmol/L。

2.5 方法的特異性

檢驗(yàn)方法的特異性是反映其性能的重要指標(biāo)。采用本方法對(duì)E2及4種內(nèi)分泌干擾物(甲基睪酮、己烯雌酚、雙酚A、黃體酮)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖 6a所示，圖中不同顏色柱間不同大寫字母表示數(shù)據(jù)有顯著性差異(p<0.05)；相同顏色柱間不同小寫字母表示數(shù)據(jù)有顯著性差異(p<0.05)。

圖6 不同干擾物對(duì)NaCl聚集納米金比色適配體傳感器檢測(cè)E2的特異性分析Fig.6 Selectivity of colorimetric aptasensor for E2 detection based different foreign substances

圖6a表明,當(dāng)檢測(cè)濃度(0.2 nmol/L)低于檢出限(0.233 nmol/L)時(shí)，E2及4種內(nèi)分泌干擾物的A650/A530無(wú)顯著差異，而當(dāng)檢測(cè)濃度高于LOD時(shí)，如0.4～0.8 nmol/L時(shí)，總體而言，目標(biāo)物(E2)體系的A650/A530顯著高于其他4種內(nèi)分泌干擾物，己烯雌酚和雙酚A體系的A650/A530均相對(duì)較低，而甲基睪酮和黃體酮體系的A650/A530相對(duì)增大。這可能是由于適配體與靶標(biāo)是基于構(gòu)象進(jìn)行識(shí)別的[12]，如圖6b所示，甲基睪酮、黃體酮和E2均具有環(huán)戊烷及多氫菲環(huán)結(jié)構(gòu)，這使其與E2具有類似的結(jié)構(gòu)特征，故甲基睪酮和黃體酮與E2適配體間存在一定的親和度[19]。而雙酚A、己烯雌酚與E2的分子結(jié)構(gòu)區(qū)別較大，故與E2的適配體的親和度較小。該方法雖然對(duì)濃度為0.8 nmol/L的目標(biāo)物也有較好的特異性，但因?yàn)槌隽司€性檢測(cè)范圍，故E2的檢測(cè)結(jié)果與0.6 nmol/L時(shí)的結(jié)果間無(wú)顯著差異。因此，本方法在線性檢測(cè)范圍內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)E2的特異性識(shí)別和檢測(cè)。

2.6 加標(biāo)樣品的檢測(cè)

以本方法對(duì)牛奶和雞蛋的加標(biāo)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同檢測(cè)體系E2的標(biāo)準(zhǔn)曲線及紫外可見吸收光譜Fig.7 Calibration curves for E2 in different systems and UV-visible absorption spectra

圖7a表明，當(dāng)對(duì)牛奶體系中的E2進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，當(dāng)E2濃度為 0.5～0.8 nmol/L時(shí)，體系的A650/A530與E2濃度呈良好的線性關(guān)系(R2=0.900)，計(jì)算可得方法的檢出限為0.183 nmol/L。由圖7c可知，對(duì)雞蛋中的E2檢測(cè)而言，在E2濃度為0.3～0.9 nmol/L時(shí)，體系的A650/A530與E2濃度呈良好的線性關(guān)系(R2=0.920)，方法的檢出限為 0.185 nmol/L。此外，當(dāng)牛奶體系中的E2濃度高于 0.8 nmol/L，雞蛋中的E2濃度高于0.6 nmol/L時(shí)，通過(guò)肉眼即可觀察到顏色變化。牛奶、雞蛋體系中E2的加標(biāo)回收率結(jié)果如表2所示。由表2可知，E2在牛奶、雞蛋體系中的加標(biāo)回收率分別為101.6%～105.4%和97.97%～115.30%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6%，表明本方法精密度較高，準(zhǔn)確性較好，可用于實(shí)際牛奶、雞蛋樣品中E2的檢測(cè)。

表2 牛奶和蛋清樣品中E2的加標(biāo)回收結(jié)果Tab.2 Recoveries of E2 in milk and albumen samples

2.7 E2常用檢測(cè)方法對(duì)比

表3[2,4,10,12-14,28-34]列出了目前部分E2的檢測(cè)方法。包括檢出限、檢測(cè)線性范圍、檢測(cè)對(duì)象、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等信息。由表3可知，在對(duì)水體系的雌二醇進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比，本方法的LOD為0.233 nmol/L，這雖然比文獻(xiàn)[28]高，但明顯優(yōu)于文獻(xiàn)[2]的LOD。而在檢測(cè)牛奶中的雌二醇時(shí)，本方法較液質(zhì)聯(lián)用方法更為靈敏，回收率更高。與基于76 mer核酸適配體的雌二醇檢測(cè)方法相比，雖然文獻(xiàn)[34]所采用的電化學(xué)法對(duì)E2進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，LOD為6×10-5nmol/L，比本方法的LOD更低，靈敏度更高，但該方法的檢測(cè)對(duì)象為尿液。在對(duì)河水及廢水體系中的E2進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，本方法的LOD則小于熒光法、三聯(lián)體傳感體系及文獻(xiàn)[29](比色法)，具有較高的靈敏度。雖然有研究認(rèn)為使用長(zhǎng)度較短的適配體有助于提高納米金比色檢測(cè)的靈敏度[15,21]，但目前研究中應(yīng)用廣泛，識(shí)別效果優(yōu)良的仍是長(zhǎng)度為76 mer的E2核酸適配體。本方法中應(yīng)用長(zhǎng)度為76 mer的適配體也得到了與文獻(xiàn)[13]相當(dāng)?shù)腖OD，也證明了該適配體具有較好的E2識(shí)別能力。總體而言，本方法可以作為一種有效的E2快速分析方法。結(jié)果可靠，且具有較高的檢測(cè)靈敏度。尤其是當(dāng)前利用核酸適配體檢測(cè)畜、禽食品中的E2的報(bào)道還較少，而本研究所建立的方法對(duì)于牛奶和雞蛋中E2的快速檢測(cè)有很好的應(yīng)用前景。

表3 E2常用檢測(cè)方法性能對(duì)比Tab.3 Comparison of detection methods for E2

3 結(jié)束語(yǔ)

作為一種典型的雌激素，雌二醇易通過(guò)食物鏈影響人體健康。探索簡(jiǎn)單、快速、靈敏的雌二醇檢測(cè)技術(shù)對(duì)保障食品安全具有重要意義。本文提出一種基于核酸適配體的雌二醇納米金比色檢測(cè)方法。當(dāng)納米金粒子與核酸適配體濃度比1∶11 000、室溫孵育30 min后，可使核酸適配體與納米金粒子充分結(jié)合。檢測(cè)E2時(shí)，在NaCl濃度為24 mmol/L的條件下，水體系的A650/A530與雌二醇濃度間呈良好的線性關(guān)系(R2=0.915)，檢測(cè)的線性區(qū)間為0.25～0.60 nmol/L，檢測(cè)限(LOD)為0.233 nmol/L，具有良好的特異性。在對(duì)牛奶和雞蛋樣品中的雌二醇進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，該方法的線性檢測(cè)區(qū)間分別為0.5～0.8 nmol/L和0.3～0.9 nmol/L，檢測(cè)限(LOD)分別為0.183 nmol/L和0.185 nmol/L，加標(biāo)回收率分別為 101.6%～105.4%和 97.97%～115.30%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6%。基于核酸適配體的雌二醇納米金比色分析檢測(cè)方法具有較高的靈敏度和特異性，簡(jiǎn)單、快速，具有良好的應(yīng)用價(jià)值，可推廣應(yīng)用于實(shí)際畜、禽食品中的E2檢測(cè)。