骨肉瘤中EMT相關基因的來源及與患者生存預后的關系分析

彭銀虓，余 彬，秦 輝，薛 力，梁益建

(四川省成都市第三人民醫院骨科，四川成都 601131)

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的骨腫瘤類型，可導致約9%的患者死亡[1-2]。化療和手術治療可將骨肉瘤5年生存率提高60%～70%，然而，復發時合并腫瘤轉移的患者5年生存率低于30%[3-4]。因此，探索骨肉瘤的轉移機制對于改善患者預后具有重要意義。腫瘤轉移始于上皮間質轉化(EMT)，EMT是上皮細胞獲得間充質表型并具有遷移和侵襲能力的過程[5]。上皮標志物E-鈣黏蛋白的缺失和間充質標志物的表達增加是EMT的特征改變。EMT促進原代上皮樣腫瘤細胞在轉移、進展期間獲得侵襲性間充質表型，從而引發腫瘤的擴散和血管浸潤[6]。EMT相關基因可作為骨肉瘤的潛在標志物和治療靶標。然而，EMT與骨肉瘤免疫微環境間的關系報道較少。骨肉瘤表達數據中EMT相關基因特征的細胞起源，EMT和免疫活動如何共同影響骨肉瘤患者的生存預后等問題目前尚不明確。本研究基于來自3個獨立微陣列數據集的基因表達和臨床數據，以及本院臨床標本的基因表達驗證，探討了骨肉瘤中EMT相關基因的來源及與患者生存預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1公共數據庫數據 從Gene Expression Omnibus數據庫(GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)[7-9]中獲得3個獨立的微陣列數據集(GSE36001、GSE39055和GSE16091)。GSE36001包含19例骨肉瘤標本和6例基質標本，GSE39055和GSE16091分別包含37例和34例骨肉瘤標本。

1.1.2病理組織標本 病理組織標本來源于2018-2019年本院骨科確診為骨肉瘤的患者，共5例。于術中分別取骨肉瘤組織和基質組織作為骨肉瘤標本與基質標本，標本收集后采用RNA保護液儲存，置于-80 ℃冰箱保存待測。納入標準：(1)經CT或MRI等檢查明確診斷為骨肉瘤；(2)術前未進行化療或放療；(3)臨床資料完整。

1.1.3試劑 Trizol試劑購自Invitrogen公司；cDNA反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；PCR儀為賽默飛世爾科技有限公司生產的Applied Biosystems 7300；實時熒光定量PCR引物于Primer Bank網站在線獲取，由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2方法

1.2.1EMT評分 EMT相關基因標記包含從分子特征數據庫標記基因集(MSigDB，software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)中獲得的200個基因[10]。對于腫瘤基因組圖譜中的每個標本，基于EMT相關基因表達，通過單樣本基因集富集分析(ssGSEA)在R3.6.1軟件中計算EMT評分[11]。

1.2.2免疫評分、基質評分和腫瘤純度 GSE39055和GSE16091用于探討骨肉瘤EMT、免疫活性、基質活性和腫瘤純度間的相關性。使用R3.6.1軟件的ESTIMATE軟件包來評估免疫評分和基質評分[12]，用于反映免疫活性與基質活性。采用ESTIMATE軟件包定義免疫細胞和基質細胞基因特征，從基因表達數據推斷免疫成分和基質成分的比例，并將這些單個組分組合以評估腫瘤純度。

1.2.3生存分析 GSE39055的總生存率和無病生存率數據用于生存分析。分別采用EMT評分、免疫評分的中位數作為高/低EMT評分和高/低免疫評分的界值[13]。

1.2.4EMT相關基因和基質細胞基因的表達分析 GSE36001用于EMT相關基因和基質細胞基因的表達分析。計算骨肉瘤標本和基質標本之間EMT相關基因和基質細胞基因的倍數變化(FC)。

1.2.5實時熒光定量PCR 使用實時熒光定量PCR檢測本院5例骨肉瘤標本和5例基質標本中25種基因的表達水平。方法：Trizol法提取組織總RNA，反轉錄為cDNA，使用實時熒光定量PCR進行cDNA模板定量。

2 結 果

2.1骨肉瘤中EMT評分、免疫評分、基質評分和腫瘤純度間的相關性 GSE39055和GSE16091中，EMT評分與免疫評分、基質評分均呈正相關(P<0.05)，與腫瘤純度均呈負相關(P<0.05)，見圖1中A～F；腫瘤純度與免疫評分、基質評分均呈負相關(P<0.05)，見圖1中G～J。

2.2不同EMT評分、免疫評分骨肉瘤患者的生存分析 GSE39055中，高EMT評分患者總生存率、無病生存率均低于低EMT評分患者(P<0.05)，高EMT評分是骨肉瘤患者總生存率、無病生存率下降的危險因素(HR=4.977，P=0.003；HR=4.308，P=0.010)，Kaplan-Meier生存曲線見圖2A、2B；高免疫評分與低免疫評分患者總生存率、無病生存率差異無統計學意義(P>0.05)，免疫評分不是骨肉瘤患者總生存率、無病生存率下降的危險因素(HR=0.405，P=0.173；HR=0.482，P=0.134)，Kaplan-Meier生存曲線見圖2C、2D。

注：A、B分別為GSE39055和GSE16091中EMT評分與免疫評分的相關性；C、D分別為GSE39055和GSE16091中EMT評分與基質評分的相關性；E、F分別為GSE39055和GSE16091中EMT評分與腫瘤純度的相關性；G、H分別為GSE39055和GSE16091中免疫評分與腫瘤純度的相關性；I、J分別為GSE39055和GSE16091中基質評分與腫瘤純度的相關性。

注：A、B分別為EMT評分與骨肉瘤患者總生存率、無病生存率的Kaplan-Meier生存曲線；C、D分別為免疫評分與骨肉瘤患者總生存率、無病生存率的Kaplan-Meier生存曲線。

2.3EMT相關基因和基質細胞基因的表達和預后意義 為了探討骨肉瘤中EMT相關基因和基質細胞基因表達間的關系，本研究分析了數據集中基因的表達和臨床結局。GSE36001中，骨肉瘤標本EMT相關基因表達水平高于基質細胞基因(P<0.05)，見圖3A。骨肉瘤標本和基質標本之間EMT相關基因的FC高于基質細胞基因(P<0.05)，見圖3B。根據EMT和基質特征評估了單個基因的預后意義，結果顯示，在GSE39055中，與骨肉瘤患者總生存率最相關的前15個基因有10個來自EMT相關基因，與骨肉瘤患者無病生存率最相關的前15個基因有11個來自EMT相關基因，見圖3C、3D。

注：A為GSE36001中EMT相關基因和基質細胞基因的表達水平比較；B為GSE36001中EMT相關基因和基質細胞基因的FC比較；C為GSE39055中與骨肉瘤患者總生存率最相關的前15個基因；D為GSE39055中與骨肉瘤患者無病生存率最相關的前15個基因。

2.4驗證基質細胞是骨肉瘤EMT相關基因表達的關鍵來源 為了驗證骨肉瘤中EMT相關基因表達的關鍵來源，采用實時熒光定量PCR檢測本院5例骨肉瘤標本與5例基質標本中上述25種基因的表達水平，包括18種EMT相關基因(ABI3BP、AREG、CADM1、CDH6、COL1A1、COL4A2、FGF2、GPX7、LAMA2、LEPRE1、MATN3、SERPINE2、SERPINH1、SNAI2、SPARC、THY1、VCAN、VIM)，3種基質細胞基因(CD86、IL18R1、SPON1)及4種基質細胞基因和EMT相關基因(COMP、GREM1、MMP3、SGCD)。結果顯示，骨肉瘤標本中EMT相關基因表達水平高于基質細胞基因(P<0.05)，見圖4A；基質標本中基質細胞基因表達水平高于EMT相關基因(P<0.05)，見圖4B；骨肉瘤標本和基質標本之間EMT相關基因的FC高于基質細胞基因(P<0.05)，見圖4C。

注：A為骨肉瘤標本中EMT相關基因與基質細胞基因表達水平比較；B為基質標本中EMT相關基因與基質細胞基因表達水平比較；C為EMT相關基因與基質細胞基因的FC比較。

3 討 論

EMT是骨肉瘤轉移的關鍵因素[3-5,14]，且越來越多的證據表明，EMT與人類腫瘤的免疫活性有關[15-16]，但在骨肉瘤中相關報道較少。本研究在GSE39055和GSE16091數據集中基于基因表達定義了EMT的基因特征、免疫活性和基質活性，并進一步分析了EMT、免疫活性、基質活性和腫瘤純度間的相關性，結果顯示，骨肉瘤中EMT評分和免疫評分、基質評分均呈正相關，而腫瘤純度與EMT評分、免疫評分和基質評分均呈負相關，這些發現與尿路上皮癌和結直腸癌的最新相關研究結果一致[5,17-18]。

本研究結果顯示，高EMT評分是骨肉瘤患者總生存率、無病生存率下降的危險因素；且在GSE39055中，與骨肉瘤患者總生存率最相關的前15個基因有10個來自EMT相關基因，與骨肉瘤患者無病生存率最相關的前15個基因有11個來自EMT相關基因，提示EMT相關基因的表達與骨肉瘤患者的生存預后密切相關。此外，本研究發現，免疫評分不是骨肉瘤患者總生存率、無病生存率下降的危險因素。WANG等[5]在尿路上皮癌中的相關研究也發現，免疫評分不是患者生存率下降的危險因素，與本研究結果相似，提示在不同腫瘤類型中，免疫活性可能均不會影響患者的生存率。

為了進一步探索骨肉瘤中EMT相關基因的表達細胞來源，本研究分析了GSE36001數據集和本院5例骨肉瘤標本與5例基質標本中EMT相關基因、基質細胞基因的表達差異。骨肉瘤標本中EMT相關基因表達水平高于基質細胞基因；基質標本中基質細胞基因表達水平高于EMT相關基因；骨肉瘤標本和基質標本之間EMT相關基因的FC高于基質細胞基因。同時，EMT評分與基質評分呈正相關這一結果提示骨肉瘤標本中基質細胞越多，EMT相關基因表達越高，所以，基質細胞是骨肉瘤中EMT相關基因表達的關鍵來源。通過使用尿路上皮癌數據集，WANG等[5]研究發現，基于基因表達的浸潤性T細胞和EMT水平呈正相關，基質細胞是尿路上皮癌中EMT相關基因的主要表達細胞。ISELLA等[17]研究發現，EMT相關基因在基質細胞中高表達，表明EMT相關基因可能來源于基質細胞而非上皮癌細胞。

4 結 論

骨肉瘤中EMT、免疫活性、基質活性和腫瘤純度之間存在相關性；EMT相關基因的表達與骨肉瘤患者的生存預后密切相關；基質細胞是骨肉瘤中EMT相關基因表達的關鍵來源。