狼瘡性腎炎患者外周血單個核細胞中miR-21、miR-423的表達水平及臨床意義

溫莉玲，陳家佳，梁紅麗

(海南省第三人民醫院腎內科，海南三亞 572000)

狼瘡性腎炎(LN)是系統性紅斑狼瘡(SLE)累及腎臟，導致不同病理類型免疫損傷的一種疾病，可伴有蛋白尿、血尿、貧血等一系列并發癥，10%～30%的LN患者會發展為腎衰竭，而腎衰竭是導致SLE患者死亡的主要原因[1]。有研究表明，微小RNA(miRNA)作為高度保守的內源性小分子RNA，通過促進細胞活化、分化、凋亡、代謝及信號傳導等機制，參與調控LN的發生、發展[2-3]。近年來研究發現，微小RNA-21(miR-21)、微小RNA-423(miR-423)與免疫細胞、細胞因子和免疫復合物形成、沉積等免疫異常表現有關，可能在LN的發病過程中發揮著重要作用[4-5]。本研究通過檢測LN患者外周血單個核細胞(PBMC)中miR-21及miR-423的表達水平，并分析其與LN患者疾病活動度的相關性，以期為LN的發病機制研究及靶向治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2019年9月本院收治的LN患者118例作為LN組，其中男17例，女101例；年齡17～63歲，平均(34.85±9.72)歲。根據國際腎臟病學會及腎臟病理學會制訂的LN分型標準，將118例LN患者分為LN Ⅱ～Ⅲ型組39例，Ⅳ型組47例，Ⅴ～Ⅵ型組32例。根據SLE疾病活動度指數(SLEDAI)評分，將118例LN患者分為LN穩定組40例(SLEDAI評分<10分)，LN活動組78例(SLEDAI評分≥10分)。根據K/DOQI指南中慢性腎臟病分期標準，將118例LN患者分為早期LN組79例，晚期LN組39例。納入標準：(1)SLE診斷符合美國風濕病學會診斷標準，且LN經腎臟病理活檢證實；(2)臨床資料及病理資料完整，能配合本次研究。排除標準：(1)合并急性腎損傷、惡性腫瘤、血液系統疾病及其他自身免疫性疾病；(2)近1個月內服用過免疫抑制劑、激素；(3)妊娠期或哺乳期女性。另選取50例健康體檢者作為對照組，其中男10例，女40例；年齡20～65歲，平均(36.20±9.46)歲。本研究經本院倫理委員會批準，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR檢測 miR-21上游引物：5′-AGACATCATACAGAGTGTCG-3′，下游引物：5′-GCATCTAGGATCGACGTG-3′；miR-423上游引物：5′-GACTGTCAGCTGACATACAG-3′，下游引物：5′-ACTGACGATGAATACTAG-3′。抽取外周血4 mL于肝素鈉抗凝管中，分離PBMC，提取和純化miR-21、miR-423，然后在ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進行實時熒光定量PCR檢測。反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。擴增反應體系(20 μL)：1 μL引物及探針Mix(20×)，10 μL TaqMan通用混合物溶液(2×)，1.33 μL反轉錄產物cDNA，7.67 μL無核酸酶水。擴增條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃復性60 s，45個循環。每個反應體系中熒光信號達到設定閾值所經歷的循環數即為Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miR-21及miR-423的相對表達水平。

1.2.2實驗室相關指標檢測 采用酶聯免疫吸附試驗檢測抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體水平，試劑由上海科新生物技術股份有限公司提供；紅細胞沉降率(ESR)使用意大利ALIFAX公司生產的Roller 20全自動血沉儀進行檢測；清蛋白(ALB)、C反應蛋白(CRP)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、血尿酸(UA)、補體C3、補體C4在羅氏全自動生化分析儀上進行檢測，操作前檢查當天室內質控和當月室間質評結果均在控，操作過程均嚴格按照儀器及配套試劑說明書進行。

2 結 果

2.1各組一般資料及實驗室指標比較 LN組、LN活動組和LN穩定組抗dsDNA抗體、ESR、CRP、SCr、BUN及UA水平均明顯高于對照組(P<0.05)，補體C3、補體C4及ALB水平均明顯低于對照組(P<0.05)；LN活動組SLEDAI評分、抗dsDNA抗體、SCr、BUN及UA水平均明顯高于LN穩定組(P<0.05)，ALB水平明顯低于LN穩定組(P<0.05)；LN活動組和LN穩定組補體C3、補體C4、ESR及CRP水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；各組間性別、年齡及體質量指數(BMI)比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組一般資料及實驗室指標比較

組別n補體C4(x±s,g/L)ALB(x±s,g/L)CRP(x±s,mg/L)SCr(x±s,μmol/L)BUN(x±s,mmol/L)UA (x±s,μmol/L)對照組500.35±0.1248.63±8.203.62±1.1547.50±8.242.15±0.84235.35±52.80LN穩定組400.18±0.07*35.70±6.14*11.82±4.30*78.52±14.36*8.35±2.74*328.40±65.72*LN活動組780.13±0.05*27.48±5.36*#14.36±5.24*163.40±35.80*#14.26±5.38*#466.82±85.40*#LN組1180.16±0.08*30.85±5.73*12.73±4.58*128.35±22.46*11.95±4.60*417.60±72.83*F/χ24.4826.2403.9757.2186.7243.826P0.005<0.0010.014<0.001<0.0010.018

注：與對照組比較，*P<0.05；與LN穩定組比較，#P<0.05；—為無數據。

2.2各組PBMC中miR-21及miR-423表達水平比較 LN組、LN活動組和LN穩定組PBMC中miR-21及miR-423表達水平均明顯高于對照組(P<0.05)，且LN活動組PBMC中miR-21及miR-423表達水平均明顯高于LN穩定組(P<0.05)。見表2。

表2 各組PBMC中miR-21及miR-423表達水平比較

2.3LN不同分型患者PBMC中miR-21及miR-423表達水平比較 Ⅱ～Ⅲ型組、Ⅳ型組、Ⅴ～Ⅵ型組PBMC中miR-21及miR-423表達水平均明顯高于對照組(P<0.05)；Ⅴ～Ⅵ型組和Ⅳ型組PBMC中miR-21及miR-423表達水平均明顯高于Ⅱ～Ⅲ型組(P<0.05)。見表3。

表3 LN不同分型患者PBMC中miR-21及miR-423表達水平比較

2.4LN不同分期患者PBMC中miR-21及miR-423表達水平比較 晚期LN組和早期LN組PBMC中miR-21及miR-423表達水平均明顯高于對照組(P<0.05)；晚期LN組PBMC中miR-21及miR-423表達水平均明顯高于早期LN組(P<0.05)。見表4。

表4 LN不同分期患者PBMC中miR-21及miR-423表達水平比較

2.5LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達水平與各實驗室指標的相關性 Pearson相關分析結果顯示，LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達水平與抗dsDNA抗體、SCr、BUN水平及SLEDAI評分均呈正相關(P<0.05)，與補體C3、補體C4及ALB水平均呈負相關(P<0.05)，與ESR、CRP及UA水平均無明顯相關性(P>0.05)。見表5。

表5 LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達水平與各實驗室指標的相關性

3 討 論

LN是SLE合并雙腎明顯損害的免疫性疾病，現常用于反映LN疾病活動度的臨床指標包括ESR、CRP、抗dsDNA抗體、補體C3、補體C4等，但這些指標靈敏度和特異度不高，且檢測結果影響因素較多，尚不能成為評估LN疾病活動度及預后判斷的最佳標志物。miRNA是一類長度為18～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，在細胞增殖和分化、細胞代謝和凋亡等方面發揮著重要作用，并參與機體的生理、病理過程[6]。有研究表明，miRNA能夠通過改變淋巴細胞功能，控制炎癥因子合成釋放，改變免疫細胞反應活性或影響核因子κB、Toll樣受體等信號通路參與LN發病及病情進展過程[7]。近年的研究發現，miR-21及miR-423在腎臟病患者的腎組織、血液和尿液中異常表達，參與調節腎臟功能，有望成為診斷腎臟疾病的生物標志物[8-9]。

本研究結果顯示，LN組、LN活動組和LN穩定組PBMC中miR-21、miR-423表達水平均明顯高于對照組，且LN活動組miR-21、miR-423表達水平均高于LN穩定組，提示PBMC中miR-21、miR-423表達水平變化與LN患者疾病活動度有關，可作為監測LN患者疾病活動度的參考指標。TRIONFINI等[10]研究發現，LN患者miRNA 表達水平明顯高于健康者，miRNA通過調控靶基因參與調節腎臟功能，并與腎臟損傷的發生、發展有關。本研究中，LN不同分型患者PBMC中miR-21及miR-423表達水平均明顯高于健康對照者，且Ⅴ～Ⅵ型和Ⅳ型患者PBMC中miR-21及miR-423表達水平均明顯高于Ⅱ～Ⅲ型患者；晚期和早期LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達水平均明顯高于健康對照者，且晚期LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達水平均明顯高于早期LN患者。說明miR-21及miR-423表達水平與LN患者的病情嚴重程度密切相關，Ⅴ～Ⅵ型和晚期LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達水平升高更明顯，其可能參與了LN的發生和發展過程，有望作為監測LN患者病情變化的參考指標。蘇美玲等[11]研究顯示，Ⅳ+Ⅴ型LN患者血清miR-4762-5p表達水平明顯高于Ⅳ型患者和健康對照者，且與尿蛋白增加和腎臟功能受損有關，可作為鑒別LN病理類型的生物標志物。KHOSHMIRSAFA等[12]研究發現，活動性腎炎組PBMC中miR-21表達水平明顯高于非活動性腎炎組和健康對照組，miR-21升高是LN發病的重要危險因素，可作為LN疾病活動度評估的生物標志物。此外，本研究Pearson相關分析結果顯示，LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達水平與抗dsDNA抗體、SCr、BUN水平及SLEDAI評分均呈正相關，與補體C3、補體C4及ALB水平均呈負相關。提示miR-21及miR-423表達水平與LN患者腎臟功能變化及疾病活動度有關，在LN患者疾病活動度及病情評估中具有一定的臨床價值。NAKHJAVANI等[13]的研究表明，與健康對照者相比，LN患者miR-21及miR-423表達水平明顯升高，二者參與了LN的病理、生理過程，可作為LN診斷和治療的潛在生物標志物。

4 結 論

LN患者PBMC中miR-21及miR-423表達水平明顯升高，且miR-21及miR-423表達水平升高與疾病活動度及病情嚴重程度密切相關，可能在LN的發病機制中發揮一定作用，可以為早期診斷、治療和預防LN提供新的方向。