UFLC-MS/MS法同時測定枳實中6個活性成分的含量

楊寶田，關 皎，賈 桐，朱鶴云

(1.吉林省白山市食品藥品檢驗所，吉林 白山 134300；2.吉林醫藥學院藥學院，吉林 吉林 132013)

枳實(Aurantiifructusimmaturus)，又名酸橙，始載于《神農本草經》，列為中品，原文記載“枳實主大風在皮膚中，如麻豆苦癢，除寒熱結，止利，長肌肉，利五臟，益氣輕身，生川澤”。2015版中國藥典記載枳實為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種或甜橙CitrussinensisOsbeck 的干燥幼果，具有破氣消積、化痰散痞等功效[1]。枳實為“藥食同源”類植物資源，廣泛分布于四川、江西、福建、江蘇等地區。枳實中含有的主要活性成分為黃酮類化合物，包括柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、異柚皮苷、柚皮素、橙皮素等，文獻報道，枳實中的黃酮類成分具有抗炎、鎮痛、降低毛細血管通透性、抗氧化等多種生物活性[2-5]。目前，針對枳實中黃酮類活性成分進行含量測定主要采用高效液相色譜法[6-9]，存在分析時間長、靈敏度低、專屬性差等缺點，難以滿足高通量樣品分析的要求。近年來，超快速液相色譜-質譜聯用(UFLC- MS/MS)技術由于具有靈敏度高、選擇性強、定量準確、分析速度快等優點，越來越多的應用于中藥的質量控制研究[10-11]。本試驗建立UFLC-MS/MS法同時測定枳實中6個黃酮類活性成分(異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素)的含量，所建立的分析方法分析時間明顯縮短，分析效率顯著提高，可為枳實的質量評價提供科學依據，同時為天然藥物應用于獸醫獸藥領域提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 3200 QTRAP質譜儀(配備電噴霧離子源，Analyst 1.5.1數據采集和定量處理軟件，美國AB Sciex公司)；Prominence UFLC型超高快速液相色譜儀(配備Prominence SIL-20AHT自動進樣器、LC-20AD二元泵、CTO-20A柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器和LC solution色譜工作站，日本島津公司)；KQ-250DE型數控聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CPA 225D型電子天平(德國賽多利斯儀器有限公司)；XK96-A快速混勻器(江蘇新康醫療器械有限公司)；FW80型微型高速萬能試樣粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料 柚皮苷對照品(批號：110722-201815)、橙皮苷對照品(批號：110721-201818)和新橙皮苷對照品(批號：111857-201703)，均購自中國食品藥品檢定研究院；異柚皮苷對照品(批號：16081802)、柚皮素對照品(批號：17061301)、橙皮素(批號：17072601)，均購自成都普菲德生物技術有限公司，純度均大于98%。乙腈和甲醇為色譜純(美國Fisher科技公司)，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。枳實藥材，購自沈陽市國大藥房，產地為四川省，經吉林醫藥學院生藥教研室李景華副教授鑒定為蕓香植物酸橙(CitrusanrantiumL.)的干燥幼果，樣品存留于吉林醫藥學院藥學院中藥樣品室。

1.3 色譜條件 采用Shim-Pack XR-ODS色譜柱(75 mm×3.0 mm，2.2 μm)，預柱為C18保護柱(4 mm×3.0 mm，2.2 μm)，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～10 min，10%→30%B；10～12 min，30%→60%B；12～15 min，60%→85%B)，平衡時間為3 min，流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為5 μL。

1.4 質譜條件 離子源為電噴霧離子源(ESI源)，負離子方式檢測，源噴霧電壓5 500 V，輔助加熱氣溫度550 ℃，霧化氣、輔助氣和氣簾氣壓力分別為50 psi、50 psi和20 psi；掃描方式為多重反應監測(MRM)，用于定量的離子反應分別為m/z579.1→m/z270.9(異柚皮苷)、m/z579.2→m/z271.0(柚皮苷)、m/z609.1→m/z301.2(橙皮苷)、m/z609.2→m/z301.1(新橙皮苷)、m/z301.1→m/z151.0(柚皮素)和m/z271.1→m/z150.9(橙皮素)。異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的碰撞能量(CE)分別為34、45、40、48、33 eV和26 eV。異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素混合對照品和樣品的MRM色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)和樣品(B)MRM色譜圖Fig.1 Mixed reference substance (A) and sample (B) MRM chromatogram1:異柚皮苷;2:柚皮苷;3:橙皮苷;4:新橙皮苷;5:柚皮素;6:橙皮素1:Isonaringin;2:Naringin;3:Hesperidin;4：Neohesperidin;5:Naringenin;6:Hespereti

1.5 溶液的制備

1.5.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇配制成異柚皮苷、橙皮苷、柚皮素和橙皮素質量濃度為0.1 mg/mL、柚皮苷和新橙皮苷質量濃度為1.0 mg/mL的單一成分對照品儲備液，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.5.2 供試品溶液的制備 精密稱取枳實藥材粉末(過40目篩)0.1 g，置50 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲(功率250 W，頻率50 kHz)處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾。精密量取續濾液0.5 mL，置于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2 結果

2.1 線性關系考察 分別精密吸取“1.5.1”項下的各對照品溶液適量，置于同一5 mL容量瓶中，用甲醇配制成異柚皮苷濃度分別為0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 μg/mL和8.0 μg/mL，柚皮苷濃度分別為1、2、5、10、20 μg/mL和 40 μg/mL，橙皮苷濃度分別為0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 μg/mL和8.0 μg/mL，新橙皮苷濃度分別為0.5、1、2.5、5、10 μg/mL和20 μg/mL，柚皮素濃度分別為0.02、0.04、0.1、0.2、0.4 μg/mL和0.8 μg/mL，橙皮素濃度分別為0.02、0.04、0.1、0.2、0.4 μg/mL和0.8 μg/mL的系列混合對照品溶液。依次注入超快速液相色譜-質譜聯用儀，測定峰面積。以對照品的濃度(X，μg/mL)為橫坐標，峰面積的積分值(Y)為縱坐標，進行線性回歸，得出異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的線性回歸方程分別為：

Y=4.109×104X-4.544×103r=0.999 2

Y=2.640×104X+5.622×103r=0.999 4

Y=2.871×104X-3.552×102r=0.999 7

Y=6.469×104X+1.247×104r=0.999 2

Y=3.553×104X-2.849×102r=0.999 7

Y=7.043×104X+1.877×102r=0.999 7

結果表明，異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素分別在0.2～8.0 μg /mL、1.0～40 μg/mL、0.2～8.0 μg/mL、0.5～20 μg/mL、0.02～0.8 μg/mL和0.02～0.8 μg/mL濃度范圍之內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2 精密度試驗 精密吸取“2.1”項下制備的異柚皮苷質量濃度為2.0 μg/mL、柚皮苷質量濃度為10 μg/mL、橙皮苷質量濃度為2.0 μg/mL、新橙皮苷質量濃度為5 μg/mL、柚皮素質量濃度為0.2 μg/mL和橙皮素質量濃度為0.2 μg/mL的混合對照品溶液 200 μL，注入樣品瓶中，置于樣品架上。按上述色譜條件連續進樣6 次，記錄峰面積。結果異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素峰面積的RSD分別為2.6%、2.0%、2.7%、1.9%、1.6%和2.5%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液200 μL，注入樣品瓶中，置于樣品架上，在室溫下分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12 h和24 h 進樣測定，記錄峰面積。結果異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素峰面積的RSD分別為2.7%、2.7%、2.9%、1.5%、1.4%和2.3%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.4 重復性試驗 取同一批枳實樣品6 份，分別按“1.5.2”項下方法制備供試品溶液，取供試品溶液200 μL，注入樣品瓶中，置于樣品架上，進樣測定，記錄峰面積，計算待測成分的含量。結果異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的含量平均值(n=6)分別為1.87%、11.9%、0.471%、3.14%、0.373%和0.0418%，RSD分別為1.5%、2.3%、2.8%、2.2%、2.8%和2.5%，表明方法重復性良好。

2.5 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批次枳實樣品9份，精密稱定，每份0.05 g，分別加入相當于樣品中異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素含量的80%、100%、120%的對照品溶液適量，各3份。按“1.5.2”項下的方法制備供試品溶液，進樣5 μL測定，計算異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的回收率和RSD值，結果見表1。

表1 枳實樣品中異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的回收率Table 1 Recoveries of isonaringin,naringin,hesperidin,neohesperidin,naringenin and hesperetin

2.6 樣品含量測定 精密稱取6批枳實樣品，按“1.5.2”項下的方法制備供試品溶液，進樣5 μL，每個溶液進樣3次，計算異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的含量。6批樣品測定結果見表2。

表2 枳實樣品中異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的含量Table 2 The contents of isonaringin,naringin,hesperidin,neohesperidin,naringenin and hesperetin in Aurantii fructus immaturus (%)

3 討論

3.1 色譜和質譜條件的優化 分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水4種流動相體系。結果表明，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液流動相體系能夠獲得較好的分離效果。6個待測物在電噴霧離子源負離子檢測模式下的響應明顯高于正離子模式，在負離子模式下異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素分別形成m/z579.1、m/z579.2、m/z609.1、m/z609.2、m/z301.1和m/z271.1的[M-H]-準分子離子，靈敏度較高且信號較為穩定。碰撞能量(CE)對定量結果的影響較大，試驗過程中對碰撞能量(CE)進行了優化，考察了10～50 eV范圍內異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的質譜響應，結果表明，較低CE (10～20 eV)時，6個待測物形成各自穩定的碎片離子，產生的碎片離子較少，較高CE (20～50 eV)時，母離子信號進一步降低，但產生較多的碎片離子。因此，最終選擇的異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的CE值分別為34、45、40、48、33 eV和26 eV。本試驗同時對源溫度(Source temperature)、源噴霧電壓(Ionspray voltage)等參數進行了優化。采用本試驗建立的UFLC-MS/MS分析方法測定枳實中6個活性成分時，分析時間僅為14 min，與文獻[5-8]中采用的常規HPLC相比分析時間明顯縮短，且藥材中其他色譜峰不干擾樣品的測定。

3.2 提取方法及提取溶劑的選擇 本試驗對比了回流法和超聲法提取枳實中異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的提取效果。結果表明，超聲提取30 min所得供試品中上述6個活性成分的含量均明顯高于回流提取法，因此，本試驗采用超聲提取法作為枳實中6個活性成分的提取方法。本試驗對比了50%、70%、100%乙醇溶液和50%、70%、100%甲醇溶液對枳實中6個活性成分的提取效率，結果顯示，100%甲醇的綜合提取效率最高，故本試驗采用100%甲醇作為提取溶劑。

3.3 本試驗建立UFLC-MS/MS法同時測定枳實中異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的含量，并應用該方法測定了6批枳實中上述6個活性成分的含量。本試驗建立的UFLC-MS/MS方法簡單、快速、靈敏、專屬性強，可為枳實的質量控制和體內研究提供參考。