新疆阿勒泰地區牛結核病流行病學調查

羅鵬飛，王金泉

(新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

牛結核病(Bovine tuberculosis)是由牛結核分支桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的一類人獸共患傳染病，其主要傳播途徑是呼吸道和消化道[1-2]。由于牛結核分支桿菌擁有廣泛的宿主，尤其是牛只；如若病牛產生的牛奶未經消毒就被人類飲用，則有較大幾率感染該病，同樣，人類染病也可以經接觸等途徑傳染給牛。對人結核病的發病原因統計，10%以上的原因都是由牛分枝桿菌導致[3-5]。該病在世界各地均有發生，且一年四季都可感染[6]；是世界動物衛生組織(OIE)規定通報的疫病，也是我國的二類疫病[7]。該疾病是國內外迫切需要解決的嚴重公共安全問題。

為有效控制牛結核病的流行，對新疆阿勒泰地區開展了結核病凈化工作。為了解該地區結核病的防控效果，通過對2015-2019年連續5年的牛結核病流行病學監測，以期通過該數據制定更為精確的防控手段，為該地區的凈化工作提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2015-2019年，在阿勒泰地區8個鄉鎮共計采集樣品64 442份。

1.2 檢測試劑 提純牛型結核菌素：哈藥集團生物疫苗有限公司；牛結核γ-干擾素ELSIA檢測試劑盒：青島瑞爾生物技術有限公司；DNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker：TaKaRa 公司；2×EcoTaqPCR SuperMix：北京全式金生物技術有限公司。

1.3 檢測方法 采樣數據從2015年開始統計，先對該年份的所有牛只進行牛型結核菌素皮內變態反應(PPD)普檢，將陽性牛、可疑牛只采集抗凝血，可疑牛只進行二次檢測，二次檢測仍為可疑則定為陰性。通過PPD檢測結果，隨機采集部分陰性牛血液，與陽性牛及二次檢測均為可疑牛只的抗凝血進行牛結核γ-干擾素ELISA試驗和PCR檢測，并對結果進行分析，選擇特異性最優的檢測方法對2016-2019年采集的牛進行結核病檢測。

1.3.1 牛型結核菌素皮內變態反應(PPD) 按照國標《動物結核病診斷技術》(GB/T18645-2002)[8]進行，分別于注射前和注射后12、24 h和72 h測量皮膚厚度，并計算出皮厚差，按國標統計PPD結果。

1.3.2 牛結核γ-干擾素 ELISA 試驗 采集抗凝血24 h內送回實驗室，按照說明書進行檢測。

1.3.3 PCR方法檢測 將抗凝血按照DNA提取試劑盒說明書提取DNA，PCR參照段旭基等[9]牛結核桿菌和結核分枝桿菌IS1081基因(IS-1：5′-CGACGCTCTGACCGACAAACT-3′；IS-2：5′-TGCTTGGCGGGTTCTTCG-3′；324 bp)擴增目的片段；PCR擴增體系為：95 ℃ 5 min；(94 ℃，2 min；58 ℃，1.5 min；72 ℃，2 min)35個循環；72 ℃ 10 min；PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR擴增結果陽性產物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，用NCBI提供的BLAST軟件進行比對分析。

1.4 數據分析 文中Kappa系數計算公式如下：

其中，Po為觀察符合率，Pe為機遇符合率。

2 結果

2.1 3種試驗方法的符合分析 用PPD試驗對12 115頭牛進行普檢，對可疑牛只進行復檢，最終確定25頭牛為陽性牛，3頭二次結果均為可疑品。陽性牛未表現出明顯臨床癥狀。隨機抽取陰性牛血樣131份(包括二次結果均為可疑的3個樣品)，總計156份樣品，進行牛結核γ-干擾素ELISA試驗和PCR檢測。

經IS1081基因引物擴增后，共有27份牛血DNA中擴增出目的片段，約324 bp，大小符合預測值(圖1)，經測序比對，確認為牛結核桿菌。

圖1 牛結核桿菌 IS1081基因序列擴增結果Fig.1 Amplification results of IS1081 gene of bovine tuberculosisM：DL-2 000 DNA Marker；1～5：牛結核桿菌樣本；6：陽性對照；7：陰性對照M：DL-2 000 DNA Marker；1～5:Samples of Mycobacterium bovis tuberculosis;6:Positive control;7:Negative control

表1 PCR方法、γ-干擾素 ELISA方法與PPD方法檢測結果Table 1 Results of PCR,γ-interferon ELISA and PPD

PCR檢測出陽性27份，陰性129份，陽性率為17.31%；PPD檢測陽性為25份，陰性131份，陽性率為16.03%，Kappa值為0.83。γ-干擾素ELISA檢測陽性26份，陰性130份，陽性率為16.67%，Kappa值為0.88。Kappa≥0.8，檢驗結果一致性很好。綜合分析，最終決定用PCR方法進行2016-2019年的流行病學調查。

對阿勒泰地區2015-2019年牛結核病檢測結果進行統計。從2015-2019年試驗結果(表2) 可看出，牛結核病總平均陽性率為0.18%，從2015年的0.22%降至2019年的0.09%；其中，2015年陽性檢出率最高，達到0.22%(27/12 155)。此次結果表明，近5年阿勒泰地區牛結核病陽性率呈現下降趨勢。

表2 2015-2019年牛結核病檢測結果Table 2 Test results of bovine tuberculosis in 2015-2019

2.2 不同地區牛結核病監測結果 對該地區5年間的不同鄉鎮牛結核病進行統計(見表3)。從表3可以看出，5年內共計調查64 442頭牛，陽性114頭，平均陽性率為0.18%。其中，C鄉鎮的陽性率為0.02%(1/6 531)；其余鄉鎮陽性率分別為A(0.25%，20/8 125)、B(0.18%，14/7 988)、D(0.16%，15/9 217)、E(0.22%，23/10 336)、F(0.13%，7/5 475)、G(0.19%，16/8 512)及H(0.22%，18/8 258)。此次檢測結果表明，阿勒泰地區8個鎮(鄉)牛結核病防控效果存在明顯差異。除C鄉鎮(0.02%)外，其余7個鄉鎮的陽性率均高于農業部凈化標準(0.05%)，防控形勢依然嚴峻。

表3 2015-2019年不同地區牛結核病監測結果Table 3 Results of bovine tuberculosis in different regions from 2015 to 2019

3 討論

牛型結核菌素皮內變態反應(PPD)是國際推薦的診斷方法。其優點是該方法對人員的專業水平要求低，簡單培訓就能操作[10]，且結核菌素抗原便宜，易于推廣；但是該方法操作步驟繁瑣，耗時耗力，非特異性反應經常出現，重復性不好。γ-干擾素 ELISA 試驗可以檢測早期感染牛只，特異性較好，易于標準化；但是γ-干擾素ELISA試驗需在采血后24 h內檢測[11]，且試劑盒的成本較高。PCR方法同樣具有高敏感性和強特異性，尤其是一些臨床癥狀不明顯的隱性感染等[9,12]；且牛分枝桿菌IS1081具有高度的種屬特異性；PCR檢測的重復性較好，人為因素相對較小。目前，PPD仍為我國檢疫標準，其他方法都是輔助手段，但是在實際操作中，可以根據實際情況靈活選擇。本試驗經綜合考慮，采用PCR方法對2016-2019年牛結核病進行結核病檢測，掌握阿勒泰地區牛結核病流行情況和分布特點。

2015-2019年阿勒泰地區牛結核病總陽性率為0.18%，且每年呈下降趨勢；該病的下降趨勢主要與采取強制撲殺陽性病牛政策措施有關。此數據與蓋守睿對2009-2013年的監控數據相似[13]。近年來，阿勒泰地區獸醫部門高度重視，不斷增加經費投入，提高撲殺補助標準，強制撲殺陽性牛，并將尸體及相關產品無害化處理，切斷傳染源，對快速凈化牛結核病起到了至關重要的作用。從監測結果來看，自2019年防控措施加強后，陽性率有了明顯的下降，雖未達到農業部凈化標準(0.05%)，但防控措施仍然不可懈怠，應引起密切關注，防止疫病反彈。

對阿勒泰地區不同鄉鎮牛結核病監測結果來看，7個鄉鎮的陽性率均高于農業部標準，不同鄉鎮間牛結核病防控效果存在明顯差異，可能是由于該數據是一個綜合數據，為5年間該地區的總感染率，且調查樣品來自不同規模的養殖場，各養殖場的防控意識有所差別，故不同鄉鎮的防控結果存在區別。C鄉鎮的規模養殖場較多，且防控意識較高，故該地區5年僅發現1例陽性。而A鄉鎮自繁自養居多，且牲畜交易頻繁，應加強該地的監控及防控措施。

為今后有效控制凈化該病，相關部門應不斷完善病牛的撲殺補償機制，增強該病的監督和保障機制；并且加強動物檢疫工作，發現陽性病牛應立即撲殺并做好無害化處理[14]。對外來牲畜的檢疫工作不容忽視，嚴禁感染牛只引入。由于結核病為人獸共患病，可與人結核病交叉感染，一定要增強畜主的防范意識，避免交叉感染。