三疣梭子蟹C-JUN氨基末端激酶基因克隆及在病原脅迫后的表達特征分析*

張云濱 任憲云 高保全 呂建建 王 磊 劉 萍

三疣梭子蟹C-JUN氨基末端激酶基因克隆及在病原脅迫后的表達特征分析*

張云濱1,3任憲云2,3高保全2,3呂建建2,3王 磊1,3劉 萍2,3①

(1. 上海海洋大學 水產科學國家級實驗教學示范中心 上海 201306；2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071；3. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 青島 266071)

C-JUN氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)作為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的重要一員，在細胞增殖、凋亡和免疫應激等過程中發揮著重要作用。為深入研究基因的免疫防御機制，本研究從三疣梭子蟹()轉錄組數據庫中篩選到基因的EST序列，利用RACE擴增技術克隆得到該基因全長序列，命名為，cDNA全長為3240 bp，開放閱讀框(ORF)為1380 bp，編碼459個氨基酸，具有TPY磷酸化位點的S_TKC保守結構域，是基因家族典型特征。組織表達分布結果顯示，基因在所有組織中均有表達；Real-time PCR檢測不同病原刺激下基因的表達水平，結果顯示，注射副溶血弧菌()后，該基因顯著下調表達(<0.05)；而注射白斑綜合征病毒(WSSV)后，該基因顯著上調表達(<0.05)。綜上所述，基因是一種廣泛表達基因，且在不同的病原感染情況下，該基因的表達模式存在差異，在免疫防御過程中具有重要作用。

三疣梭子蟹；；基因克隆；病原感染；實時熒光定量PCR

C-JUN氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)在1990年被發現，是形成絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的重要亞基。基因家族具有THR-Pro-Tyr(TPY)磷酸化位點的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(S_TKC)典型結構域，是上游基因MKK4與MKK7的激活區域，磷酸化的可激活下游各種轉錄因子(Davis, 2000; Minden, 2008)和非轉錄因子(Lin, 2003)，參與細胞增殖(Zhang, 2002)、凋亡(Kyriakis, 1994)、分化和免疫應激(Huang,2009)等生理過程。國內外研究者發現，JNK可介導多種外界因素引起的細胞凋亡，如Dhanasekaran等(2008)研究發現，JNK可活化其下游轉錄因子c-JUN/AP-1的活性，進而調節凋亡蛋白的表達；活化P53基因的表達可調節細胞凋亡(Jones, 2008)；JNK還可以介導非轉錄因子BCL-2家族基因的表達來調節細胞凋亡(Aoki, 2002)。JNK除在細胞凋亡中發揮重要作用外，在機體免疫應激過程中也發揮重要作用，如在果蠅()中，JNK基因可以激活脂肪體中抗菌肽基因的表達，參與對致病菌(Bond, 2009)、真菌(Sluss, 1996)和病毒(Delaney, 2006)的免疫防御；Shi等(2012)在凡納濱對蝦()中獲得的JNK同源基因與WSSV的復制和基因轉錄有關；Zhu等(2016)在中華絨螯蟹()中發現，JNK信號通路可調節抗菌肽(AMPs)的表達。可見JNK在機體的免疫防御過程中具有極其重要的作用。然而，在三疣梭子蟹()中，有關JNK是否參與細胞凋亡、免疫防御的作用機制尚未見報道。

三疣梭子蟹具有較高的經濟價值，是我國重要的海產養殖品種(任海波等, 2018）。但由于養殖環境的破壞與病害頻發，三疣梭子蟹養殖規模呈現下降的趨勢，其中，副溶血弧菌()和白斑綜合征病毒(WSSV)是導致三疣梭子蟹病害頻發的主要病原(周俊芳等, 2014; 李盧, 2005; 閻斌倫等, 2010)。因此，本研究采用RACE技術克隆三疣梭子蟹的基因，通過生物學軟件分析其基因結構與功能，并利用實時熒光定量技術(qRT-PCR)對其在不同病原感染下的表達模式進行分析，為進一步探索三疣梭子蟹基因在免疫防御中的作用機制提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品的獲取

三疣梭子蟹采集于山東省濰坊市昌邑海豐養殖基地，選擇健康的三疣梭子蟹200只[(25±3) g]，在10 m2的室內水池中暫養7 d，水溫為(25±2)℃，鹽度為33，持續充氧，為保證水質良好，每天換水1/3，定時、定點、定量投喂新鮮雜魚，投喂量為其體重的30%左右。隨機選取3只暫養后的健康三疣梭子蟹，分別取其10個組織(腦、肝胰腺、血細胞、肌肉、胸腺、腸、眼柄、胃、鰓和心臟)存于液氮，用于組織表達分布分析，其中，血細胞800×g 4℃離心10 min，去上清液，保留血細胞，并保存于液氮中。

將剩余的健康三疣梭子蟹平均分為3組，即對照組(甲殼動物生理鹽水)、副溶血弧菌感染組(1×107CFU/ml)和WSSV(3.7×107copy/ml)感染組，每組50只以確保有足夠的取樣個體數量，濃度參照張杰等(2018)，注射量為100 μl，分別在感染0、3、6、12、24、48和72 h時取其鰓、肝胰腺和血細胞組織，每組取3只混合放置在1.5 ml離心管中。其中，血細胞800×g 4℃離心10 min，去上清液，保留血細胞，并保存于液氮中，用于后續總RNA提取等。

1.2 總RNA提取與RACE模板合成

將保存于液氮未處理的組織進行充分研磨，采用TRIzol?Reagent(Roche公司)方法進行總RNA提取，然后進行1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(NanoDrop 2000, Thermo)檢測其質量和濃度，將高質量的RNA進行分裝保存(–80℃)。將各組織中高質量的總RNA均勻混合，并使用SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit (TaKaRa公司)試劑盒合成3′和5′ RACE cDNA模板(–80℃分裝保存)，用于后續基因克隆實驗。

1.3 PtJNK基因cDNA全長擴增

根據三疣梭子蟹轉錄組數據庫篩選得到的EST序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計3′和5′ RACE特異性引物及通用引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)，使用Trans?DNA高保真聚合酶(北京全式金生物公司)進行3′和5′末端巢式PCR擴增，第1輪使用UPM通用引物，10 μl反應體系：0.5 μl模板、0.4 μl Forward/Reverse Primer (10 μmol/L)、5 μl Premix(LAVer 2.0)、ddH2O補足；程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個循環；72℃ 10 min。第2輪以第1輪反應為模板，使用NUP通用引物，20ml反應體系，程序：94℃ 5min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個循環；72℃ 10 min。將獲得的PCR產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測合理的目的條帶進行切膠回收(TaKaRa Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0)，與pMD-18T載體(TaKaRa)連接3 h，轉化至DH5α大腸桿菌感受態細胞(TSINGKE)中，涂布于含氨芐的固體培養基上，37℃恒溫過夜培養，挑取陽性單克隆，加入含100 μg/ml氨芐的LB液體培養基中，37℃ 200 r/min振蕩培養4 h，用M13-47/48引物進行菌落PCR鑒定，并將檢測準確的目的菌液送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

表1 本研究所用引物序列

Tab.1 Nucleotide sequences of the PCR primers used in this study

1.4 PtJNK基因序列生物信息學分析

利用Contig Express軟件將3′和5′克隆序列與EST序列進行拼接、驗證，得到基因的cDNA全長，利用NCBI-BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線軟件對基因序列進行比對，并使用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi)在線軟件預測基因序列的開放閱讀框(ORF)。利用ExPASy(http://cn.expasy.org/tools/pi_tool.html)、SMART (http://smart.embl-heidelberg.de)、SignalP 4.1 (http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線生物學分析軟件對基因編碼的氨基酸進行物理性質、結構域、跨膜結構域和信號肽的預測。使用DNA MAN 5.2.9軟件對不同物種的氨基酸序列進行多重序列比對，并通過MEGA 6.0軟件(Tamura, 2011)采用鄰接法(Neighbor-Joining method) (Saitou, 1987)進行系統進化樹的構建。

1.5 PtJNK基因組織表達分析

將提取的總RNA用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) kit (南京諾維贊)進行反轉錄成cDNA，用于組織表達定量檢測。根據基因的全長序列，通過Primer Premier 5.0軟件設計qRT-PCR特異性引物，內參基因選用β-actin(表1)。采用10 μl qRT-PCR體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (2×) 5.0 μl，正/反向引物(10 μmol/L) 0.4 μl，ROX Reference DyeⅡ (50×) 0.2 μl，cDNA模板2.0 μl，滅菌水3.0 μl。反應程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環；95℃ 15 s，60℃ 1.0 min，95℃ 15 s。采用2–??Ct方法(Livak, 2001)對熒光定量結果進行分析，并通過SPSS 19.0軟件進行顯著性分析(<0.05)。

2 結果

2.1 PtJNK基因全長與序列結構特征

利用RACE方法得到三疣梭子蟹基因全長序列3240 bp，命名為(GenBank登錄號：MK28792)(圖1)。生物學軟件分析顯示，該基因包含5′非編碼區668 bp，3′非編碼區1192 bp，其開放閱讀框(ORF)1380 bp，編碼459個氨基酸，預測分子量為51.7 kDa，理論等電點為6.47。SMART、Signal 4.1在線軟件分析顯示，該氨基酸序列具有TPY磷酸化位點的S_TKC保守結構域(圖2)，屬于基因家族典型結構特征，無信號肽及跨膜結構域。

2.2 PtJNK氨基酸同源性與系統進化樹分析

利用Blast在線軟件對氨基酸序列和其他物種的JNK氨基酸序列進行同源性比對，結果顯示，PtJNK氨基酸序列與鋸緣青蟹() SpJNK氨基酸序列同源性最高(91.7%)，其次是中華絨螯蟹EsJNK(89.98%)、凡納濱對蝦PvJNK(88.52%)、日本對蝦()PjJNK(87.90%)。利用DNA MAN對多個序列進行同源性比對發現(圖3)，每個氨基酸序列都具有TPY磷酸化位點的S_TKC保守結構域結構。通過對多個氨基酸序列構建系統進化樹發現(圖4)，三疣梭子蟹與鋸緣青蟹和中華絨螯蟹聚為一支，其次與凡納濱對蝦和日本對蝦聚為一類。

2.3 PtJNK基因組織表達分析

2.3.1全組織相對表達分析 利用qRT- PCR技術對三疣梭子蟹不同組織的mRNA進行相對表達定量檢測，結果顯示(圖5)，在各組織中都有表達，且表達存在顯著差異(<0.05)。實驗以肝胰腺作為對照，其中，胃和肌肉中的表達量最高(與肝胰腺的表達水平相比分別為3.98和3.78倍)；其次在鰓的表達水平是肝胰腺的1.79倍；在心臟略低于肝胰腺的表達水平，在血細胞的相對表達量較低。因此，推測可能在三疣梭子蟹中發揮不同的作用，其作用因組織類型的不同而不同。

圖1 三疣梭子蟹PtJNK基因cDNA全長及其編碼的氨基酸序列

起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)用方框標出；陰影部分為S_TKC保守結構域；TPY磷酸化位點用單下劃線標出

Boxes: Start codon (ATG) and stop codon (TAG); Shadow: S_TKC Conservative domain; Underline: TPY phosphorylation

圖2 三疣梭子蟹PtJNK基因編碼蛋白結構域位置

圖3 三疣梭子蟹PtJNK氨基酸序列的多序列比對

各物種名稱及GenBank登錄號：三疣梭子蟹MK28792；鋸緣青蟹AYK28495.1；中華絨螯蟹AHG95993.1；凡納濱對蝦XP_027218684.1；日本對蝦BAI87826.1；家蠶NP_001103396.1；果蠅AAB97094.1；乾木白蟻PNF21055.1；內華達古白蟻 KDR18179.1；小鼠BAA85875.1；人NP_001310231.1

Name of each species and GenBank accession numbers:MK28792;AYK28495.1;AHG95993.1;XP_027218684.1;BAI87826.1;NP_001103396.1;AAB97094.1;PNF21055.1;KDR18179.1;BAA85875.1;NP_001310231.1

圖4 基于JNK氨基酸序列構建的不同物種的系統進化樹

圖5 三疣梭子蟹PtJNK基因在不同組織中的表達

相同字母代表差異不顯著(0.05)，不同字母代表差異顯著(<0.05)，下同

Same letters indicated no significantly different (0.05), different letters indicated significantly different (?0.05). The same as below

2.3.2 不同病原刺激下基因的表達分析 本研究利用qRT-PCR技術，研究在不同的病原刺激下，三疣梭子蟹血細胞、肝胰腺和鰓中基因的表達情況(圖6)。在副溶血弧菌感染后，基因在血細胞、鰓和肝胰腺3個組織中，與對照組相比基本呈現不同程度的下調趨勢，且呈現先下降后上升再下降后趨于平衡的表達模式。在血細胞中，分別在12 h和24 h高于對照組表達量，達到最高表達水平，為對照組的1.79倍和1.54倍；在肝胰腺中，在12 h達到最高值，為對照組的0.63倍；在鰓中，在6 h達到最高表達量，為對照組的0.61倍，在48 h和72 h達到恒定水平，為對照組的0.56倍和0.59倍。

在注射WSSV后，基因在血細胞、肝胰腺和鰓3個組織中，相對對照組呈上調表達。在血細胞中呈先下降后上升再下降的表達模式，在24 h達到最大值，為對照組的18.21倍；在肝胰腺中，基因的表達整體呈先上升后下降的表達趨勢，在12 h表達量達到最大值，為對照組的4.91倍；在鰓中，基因的表達整體呈先上升后下降再上升的表達趨勢，其中，在12 h下調至最低水平，為對照組的0.38倍。

圖6 三疣梭子蟹在不同病原感染下PtJNK在血細胞(A)、肝胰腺(B)和鰓(C)中的表達模式

感染組間沒有進行差異顯著分析

No analysis was performed between infected groups

3 討論

為更加深入了解三疣梭子蟹基因的分子特征，本研究首次獲得基因的全長序列，cDNA全長為3240 bp。經生物學軟件分析，基因含有TPY磷酸化位點的S_TKC保守結構域，是C-JUN氨基末端激酶(JNK)基因家族的典型結構域。氨基酸多重序列比對結果顯示，PtJNK氨基酸序列與其他物種具有高度的保守性。系統進化樹結果表明，無脊椎動物與脊椎動物有關基因在進化上并沒有十分密切的聯系，而三疣梭子蟹基因與鋸緣青蟹、中華絨螯蟹聚為一支。綜上所述，該序列確定為三疣梭子蟹基因，且在進化上高度保守。

基因可由各種環境應激激活，如細菌或病毒感染、氧化應激等。為了深入研究基因在三疣梭子蟹中的功能，進行了病原感染實驗，并利用qRT- PCR對基因的組織表達模式進行了分析。結果顯示，該基因在各檢測組織(胃、肌肉、腸、眼柄、胸腺、鰓、腦、心臟、肝胰腺和血細胞)中均有表達，其中，在胃和肌肉中表達量最高。時恭芳(2017)在對斑節對蝦()的研究中發現，在各組織中廣泛表達，其中，在血淋巴、鰓和腸道中高表達；Sun等(2016)對蝦夷扇貝()研究發現，基因在肌肉中表達量最高。因此，推斷基因在三疣梭子蟹中可能參與多種生理表達，且因物種的不同其表達模式具有明顯的差異。

在無脊椎動物中，血細胞(Wang, 2005; Bachère, 2004; Xiao, 2013)、肝胰腺(Diggles,2000; Wang, 2012)被認為是主要的免疫器官，在宿主對外來病原體的免疫防御中發揮重要作用。為進一步研究基因的功能，本研究對血細胞、鰓和肝胰腺3個組織進行了表達定量分析。研究發現，在注射副溶血弧菌后，基因在血細胞、鰓和肝胰腺中的表達呈現一定程度的下調表達(<0.05)，在3 h后，該基因的表達量呈先上升后下降的模式，而在對凡納濱對蝦(Li, 2015)和近江牡蠣() (Qu, 2016)中研究發現，基因呈上調表達，且在病原感染的過程中發揮著免疫調節作用，因此，推測副溶血弧菌導致三疣梭子蟹機體紊亂，引起基因表達受到抑制，表明基因參與了三疣梭子蟹免疫防御過程。WSSV感染后發現，在所觀察的血細胞、肝胰腺和鰓中均呈現顯著的上調表達(<0.05)，分別在24 h、12 h和48 h達到最大值，為對照組的18.21倍、4.9倍和11.68倍，這與凡納濱對蝦的研究結果相似：Shi等(2012)的研究證明了該基因具有抑制WSSV復制的功能，Li等(2015)證明了JNK途徑的激活(包括MKK7/ JNK/AP-1)可以增強抗菌肽(AMPs)的產生。另有研究發現，在病毒感染過程中，JNK信號通路參與病毒復制和調控特定病毒蛋白的表達(Sun, 2018; Li, 2015; Wei, 2015)，而抗菌肽在機體免疫調節中具有重要的作用，這進一步證實了基因在三疣梭子蟹免疫防御過程中起調節作用。

綜上所述，本研究首次成功克隆得到三疣梭子蟹的基因序列全長，并對其氨基酸序列進行了生物學分析，通過病原感染實驗檢測基因在血細胞、肝胰腺和鰓中的相對表達量，初步證實了基因在三疣梭子蟹感染病原的過程中發揮著重要的作用，為深入研究基因的功能作用機制提供了理論參考。

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Cloning and Expression Analysis of c-Jun N-Terminal Kinase Gene inafter Pathogenic Stress

ZHANG Yunbin1,3, REN Xianyun2,3, GAO Baoquan2,3, Lü Jianjian2,3WANG Lei1,3, LIU Ping2,3①

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071; 3. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao 266071)

The c-Jun N-terminal kinase (JNK) is a member of the mitogen-activated protein kinase superfamily, which plays an important role in cell proliferation, apoptosis, and immune stress. To further explore the immune defense mechanism of JNK in, the EST sequence ofwas isolated from the transcriptome database of. In this study,the JNK gene of() was successfully cloned by RACE; measurements showed a cDNA length of 3240 bp and an open reading frame of 1380 bp. PtJNKconsists of 459 amino acids, including a serine/threonine protein kinase (S-TKc) domain with a conserved Thr-Pro-Tyr (TPY) motif, which is a typical feature of the JNK gene family. The results of tissue expression and distribution show that thegene is expressed in all tissues. Real-time PCR was used to detect the expression ofunder different pathogenic stimuli. The results show that expression of the gene is significantly down-regulated after injection of(<0.05), while expression is significantly up-regulated when white spot syndrome virus is injected (<0.05). To sum up,gene is a widely expressed gene, and expression of the gene differs according to pathogen.

;; Gene cloning; Pathogenic infection; Quantitative Real-time PCR

LIU Ping, E-mail: liuping@ysfri.ac.cn

S917.4

A

2095-9869(2020)05-0011-09

10.19663/j.issn2095-9869.20190630001

http://www.yykxjz.cn/

張云濱, 任憲云, 高保全, 呂建建, 王磊, 劉萍. 三疣梭子蟹C-JUN氨基末端激酶基因克隆及在病原脅迫后的表達特征分析. 漁業科學進展, 2020, 41(5): 92–100

Zhang YB, Ren XY, Gao BQ, Lü JJ, Wang L, Liu P. Cloning and expression analysis of c-Jun N-terminal kinase gene inafter pathogenic stress. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(5): 92–100

* 國家蝦蟹產業技術體系(CARS-48)、國家自然科學基金面上項目(41576147; 41876186)、泰山領軍人才工程高效生態農業創新類計劃項目(LJNY2015002)、江蘇省重點研發計劃(面上項目)(BE2017325)和中央級公益性科研院所基本科研業務費(20603022018027)共同資助[This work was supported by the National Shrimp and Crab Industry Technology System (CARS-48), the National Natural Science Foundation of China (41876186; 41576147), the Project of Taishan Scholars Leading Talent (LJNY2015002), the Key Research and Development Plan of Jiangsu Province (BE2017325), and Central Level Public Welfare Research Institutes Basic Research Business Expenses (20603022018027)]. 張云濱，E-mail: 930476134@qq.com

劉 萍，研究員，E-mail: liuping@ysfri.ac.cn

2019-6-30,

2019-07-29

(編輯 馮小花)