利用mini-Tn10轉座子文庫篩選鰻弧菌M3表型發(fā)生變化的基因

李 倩 李貴陽 李 杰 莫照蘭,

利用mini-Tn10轉座子文庫篩選鰻弧菌M3表型發(fā)生變化的基因

李 倩1李貴陽2李 杰2莫照蘭1,2①

(1. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071)

為了尋找影響鰻弧菌()表型變化的基因，本研究使用轉座子mini-Tn10 (pLOF/Kana)構建了鰻弧菌M3突變株文庫，篩選影響表型變化的菌株及相關基因，證明這些表型變化的突變子與毒力存在一定的相關性。對M3突變文庫的1152突變子進行篩選，獲得泳動能力改變的突變子1個(編號為6G_1)，酪蛋白酶活性發(fā)生改變的突變子3個(編號為5A_11、7B_12和7E_12)，明膠酶活性發(fā)生改變的突變子1個(編號為7H_1)，以及菌膜形成能力發(fā)生顯著變化的突變子3個(編號為5E_2、6A_2和6E_12)。對轉座子插入位點進一步分析顯示，一個磷酸二酯酶相關基因突變引起泳動能力增強(<0.05)，、和突變引起酪蛋白酶活性顯著減弱(<0.05)，突變引起明膠蛋白酶活性顯著減弱(<0.05)，和的突變引起菌膜形成能力明顯減弱(<0.05)。對這些表型變化的突變子進行毒力感染，發(fā)現(xiàn)野生型M3是6G_1突變子的半數(shù)致死劑量(Lethal dose 50%，LD50)的2.04倍，該突變子毒力相對增強。5A_11、7B_12和7E_12的突變子LD50分別為野生型M3的2.96、3.25和3.36倍。7H_1的LD50是野生型M3的1.25倍，5E_2、6A_2和6E_12的LD50分別為野生型M3的3.34、4.08和1.84倍，這些突變子毒力相對減弱。本研究結果為進一步闡明鰻弧菌的發(fā)病機制提供了理論基礎。

鰻弧菌；mini-Tn10轉座子；突變文庫；表型；基因

鰻弧菌()廣泛存在于大洋、河口等環(huán)境，也是多種海洋生物的正常菌群之一，一些致病性菌株可感染多種魚類，引起出血性敗血癥(Austin, 2007; 丁山等, 2018)。鰻弧菌致病包括粘附、侵襲、體內(nèi)增殖、產(chǎn)生毒素等一系列過程，而這些過程又與細菌產(chǎn)生的各種致病因子有關(Frans, 2011)。已知的致病因子包括外膜蛋白、鞭毛、蛋白酶、脂多糖和溶血素等(Norqvist, 1990; Austin, 1995; Hirono, 1996; Milton, 1996)。鞭毛參與鰻弧菌的運動，當細菌失去運動能力或運動能力下降時，其感染宿主細胞的能力明顯減弱(Ormonde, 2000)。很多胞外蛋白酶是病原菌的主要致病因子，它們可以水解組織細胞，增強其通透性，產(chǎn)生細胞毒性，最終造成組織損傷等(Naka, 2011)。鰻弧菌的金屬蛋白酶基因發(fā)生突變時，其對宿主紅細胞的溶血活性下降、毒力減弱(Mo, 2010)。Stewart等(2001)研究表明，幾乎所有的細菌都可以形成菌膜，為細菌提供物理和化學屏障，營造一種相對穩(wěn)定的狀態(tài)。菌膜使鰻弧菌能夠對消毒劑、抗生素等不利環(huán)境具有一定的耐受力，使其保持持續(xù)感染和耐藥性(Hall-Stoodley, 2004; Lindell, 2012)。一些基因參與調控鰻弧菌菌膜和毒力的形成，如能夠抑制胞外蛋白的產(chǎn)生、調控菌膜的形成，進而參與細菌毒力和耐藥性的調控(Croxatto, 2002)。可見，鰻弧菌在運動、胞外蛋白酶產(chǎn)生、菌膜形成等表型方面的變化與細菌的致病性相關。

轉座子mini-Tn10是一種微型轉座子，已被廣泛應用于多種細菌基因的功能研究，如用于鑒定炭疽桿菌()未知的調控因子及代謝途徑研究(Wilson, 2007)，用于鑒定影響蘇云金桿菌()細菌素產(chǎn)生的基因(Kamoun, 2009)。為找到影響鰻弧菌表型變化的基因，本研究使用轉座子mini-Tn10 (pLOF/Kana)構建鰻弧菌M3突變菌株文庫，篩選影響表型變化的菌株及相關基因，為進一步研究鰻弧菌的致病機理提供基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、實驗魚、引物和培養(yǎng)條件

鰻弧菌M3(AmpR)由本實驗室保存，用胰大豆蛋白胨培養(yǎng)基(TSA和TSB)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃，靜置或150 r/min搖床培養(yǎng)。

大腸桿菌()CC118 (pLOF/Kana, KanaR, AmpR)和大腸桿菌SM10(KanaR)由集美大學鄢慶枇教授惠贈，用含卡那霉素(Kana) 100 μg/ml的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、靜置或150 r/min搖床培養(yǎng)。

斑馬魚()，體長為3~4 cm，購于青島市南山花鳥蟲魚市場。實驗前暫養(yǎng)于15 L水族箱中1周，正常換水、喂食，養(yǎng)殖水溫為22℃。

TCBS固體培養(yǎng)基(含Kana 600 μg/ml)用于篩選帶有Kana抗性的鰻弧菌突變子。

1.2 鰻弧菌M3 mini-Tn10轉座子文庫構建

突變文庫的構建參照Herrero等(1990)方法并適當改進。供體菌SM10 (pLOF/ Kana)在LB [氨芐青霉素(Amp)，50 μg/ml；Kana，100 μg/ml]培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)過夜，受體菌(鰻弧菌) M3在TSB培養(yǎng)基中28℃震蕩培養(yǎng)過夜。分別離心，收集供體菌和受體菌，用新鮮培養(yǎng)基洗滌，并重懸菌體，供體菌與受體菌按1∶4的比例混合均勻，用0.22 μm的微孔濾膜過濾混合菌液，取出濾膜置于TSA平板上，28℃培養(yǎng)4 h后，用1 ml TSB培養(yǎng)基洗脫濾膜上的細菌，取50 μl涂布TCBS+Kana平板，28℃培養(yǎng)24 h。從TCBS+Kana平板上挑取單菌落，–80℃保存于96孔板中。

1.3 突變子表型檢測

對鰻弧菌轉座子突變文庫進行泳動、酪蛋白酶活性、明膠酶活性、菌膜形成能力等表型檢測。具體方法：將鰻弧菌M3及其突變文庫菌株在TSB過夜培養(yǎng)，調節(jié)菌液為OD540 nm=0.5，取2 μl菌液分別點種于含0.35%瓊脂、含1%酪蛋白、含1%明膠的TSA平板上，每組設3個重復。28℃靜置培養(yǎng)24 h后，分別測量平板上細菌的泳動圈直徑(Schaber, 2004)、酪蛋白酶產(chǎn)生直徑(Wilhelm, 2007)、明膠酶產(chǎn)生直徑(Zhou, 2013)。

應用結晶紫染色法檢測突變菌株菌膜形成能力(Lazarevic, 2005)。取OD540 nm為0.5的菌液150 μl加入96孔板中，以TSB作為空白對照。在28℃靜置培養(yǎng)24 h，用磷酸鹽緩沖液(PBS, 濃度0.2 mol/L, pH 7.0)洗滌5次后，用包音氏固定液(Bouin’s stationary liquid)固定，37℃下靜置培養(yǎng)1 h，用PBS緩沖液清洗除去殘留物，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱完全干燥后，加入結晶紫染色、蒸餾水清洗，加入乙醇溶解吸附結晶紫，然后，測定其在OD595 nm的吸光度。

1.4 轉座子插入突變子的數(shù)量及基因的確定

根據(jù)Lee等(2008)的方法確定轉座子插入突變子的數(shù)量，具體步驟：鰻弧菌M3基因為單拷貝基因，選取其作為內(nèi)參基因，基因為轉座子特有，選取其為目的基因，根據(jù)引物rpoB-for/rev、neo-for/rev(表1)擴增和片段。連接片段和片段，構建重組載體質粒，根據(jù)該質粒計算DNA拷貝數(shù)，并以該重組質粒為模板，rpoB- SYBR-for/rev、neoR-SYBR-for/rev為引物，制作標準曲線，得到擴增效率值(E和E)，再以突變子DNA為模板，進行相對定量PCR，得到ΔC和ΔC，由公式計算轉座子插入個數(shù)。

式中，ΔC為擴增基因時，突變子株DNA為模板的C與重組質粒為模板的C差值。ΔC為擴增基因時，突變子株DNA為模板的C與重組質粒為模板的C差值。

根據(jù)Xie等(2011)的方法適當改進，確定轉座子插入基因，具體步驟：根據(jù)轉座子mini-Tn10中基因序列進行特異性引物設計，具體引物序列見表1。對篩選出的8株菌株進行基因步移(Genome walking)擴增。以8株突變子菌株基因組DNA為模板，使用外引物neo-Rrev-0a和M3-1-1進行第1輪PCR；取適量的第1輪PCR產(chǎn)物反應液稀釋50倍后，使用內(nèi)引物neoR-rev-1a和M3-1進行第2輪PCR；取適量的第2輪PCR產(chǎn)物反應液稀釋50倍后，使用內(nèi)引物neoR-rev-b1和M3-1進行第3輪PCR反應。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認目的條帶后，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段、連接至載體，送上海派森諾生物技術有限公司測序，測序結果與已公布的M3基因組信息在NCBI上進行比對。

表1 本實驗所用引物

Tab.1 Primers used in this study

1.5 突變子毒力檢測

利用斑馬魚作為實驗動物，檢測突變子的毒力變化，根據(jù)楊茂成(1990)的方法，鰻弧菌野生型M3及8株突變菌株作為感染組，無菌生理鹽水作為對照組，設置細菌濃度梯度為108、107、106和105CFU/ml，TSA平板檢測活菌數(shù)。每個梯度10尾魚，每尾魚注射10 μl菌液，進行肌肉注射攻毒，記錄感染后斑馬魚的死亡情況，采用改進的寇氏法計算細菌對斑馬魚的半數(shù)致死量(Lethal dose 50%, LD50)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

細菌的泳動圈直徑、酪蛋白酶產(chǎn)生直徑、明膠酶產(chǎn)生直徑和成膜能力的吸光度采用平均值±標準差(Mean±SD)表示，并使用SPSS軟件對這些數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結果

2.1 鰻弧菌M3 mini-Tn10轉座子文庫的構建和篩選

利用mini Tn10轉座子構建鰻弧菌M3的突變文庫，得到1152株突變子。對突變子進行泳動、酪蛋白酶活性、明膠酶活性、菌膜形成能力的檢測，發(fā)現(xiàn)與野生型M3相比，突變子株6G_1的泳動能力明顯增強(<0.05)(圖1)，5A_11、7B_12、7E_12的酪蛋白酶活性顯著減弱(<0.05)(圖2)，7H_1的明膠酶活性顯著減弱(<0.05)(圖3)，5E_2、6A_2、6E_12的菌膜形成能力顯著減弱(<0.05)(圖4)。

2.2 轉座子插入突變子的數(shù)量及基因的確定

選取篩選的8株菌，利用實時PCR相對定量標準曲線法和ΔC法確定了轉座子插入個數(shù)(表2)。通過基因步移擴增法獲得轉座子插入位點，將得到的序列與M3全基因組序列進行比對，得到插入基因在M3基因組上的位置信息和編碼蛋白信息(圖5，表3)。、、、位于M3染色體Ⅰ上，1個磷酸二酯酶相關基因和位于染色體Ⅱ上。其中，磷酸二酯酶相關基因影響M3的運動能力，、、影響M3酪蛋白酶產(chǎn)生，影響M3明膠蛋白酶產(chǎn)生，和影響M3的菌膜形成能力。

圖1 鰻弧菌M3轉座子文庫突變子泳動能力檢測

不同字母表示組間差異顯著(<0.05)，下同

Data with different letters are significantly different among different groups (<0.05), the same as below

圖2 鰻弧菌M3轉座子文庫突變子酪蛋白酶活性檢測

圖3 鰻弧菌M3轉座子文庫突變子明膠酶酶活性檢測

圖4 鰻弧菌M3轉座子文庫突變子菌膜形成能力檢測

表2 目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率及ΔC值

Tab.2 Amplification efficiency and ΔCt of target gene neoR and reference gene rpoB

2.3 突變子毒力檢測

肌肉注射攻毒實驗結果見表4。由表4可知，突變子6G_1的LD50為5.439×104CFU/尾，野生型M3是該突變子的2.04倍，突變子5A_11、7B_12和7E_12的LD50分別為3.29×105、3.734×105、和3.734×105CFU/尾，分別為野生型M3的2.96、3.25和3.36倍。7H_1的LD50為1.374×105CFU/尾，是野生型M3的1.25倍，5E_2、6A_2和6E_12的LD50分別為3.716×105、4.453×105和2.052×105CFU/尾，分別為野生型M3的3.34、4.08和1.84倍。

圖5 轉座子插入位點及基因

表3 轉座子插入位點信息

Tab.3 Information of transposon insertion site

3 討論

本研究利用mini-Tn10轉座子構建了鰻弧菌M3的突變文庫，篩選得到影響細菌泳動、酪蛋白酶活性、明膠酶活性、菌膜形成能力的突變子菌株，通過基因步移和序列比對，找到影響上述表型的相關基因。結果顯示，1個磷酸二酯酶相關基因的突變引起泳動能力增強(<0.05)，毒力相對增強，、、的突變引起酪蛋白酶活性明顯減弱(<0.05)，的突變引起明膠蛋白酶活性顯著減弱(<0.05)，和的突變引起菌膜形成能力明顯減弱(<0.05)且這些菌株毒力相對減弱。研究表明，細菌毒力產(chǎn)生主要包括鐵攝取系統(tǒng)、外膜蛋白、胞外蛋白酶、脂多糖和溶血素等(Weber, 2009; Naka, 2011)。O’Toole等(1996)研究發(fā)現(xiàn)，鰻弧菌鞭毛被破壞后，泳動能力減弱的菌株毒力較野生型減弱了幾百倍，表明趨化運動是鞭毛對鰻弧菌毒力的一種必需功能。Hao等(2013)研究表明，鰻弧菌基因缺失突變株因為其各種表型缺陷和調控能力喪失，致使鰻弧菌在宿主體內(nèi)存活能力下降，致病力減弱，證實了表型和毒力存在相關性。

表4 鰻弧菌M3野生型及其突變子株攻毒實驗結果

Tab.4 Experimental results of virulence of V. anguillarum M3 wild type and its mutants

磷酸二酯酶(PDES)具有水解細胞內(nèi)第二信使(環(huán)磷酸腺苷cAMP或環(huán)磷酸鳥苷cGMP)的功能，降解細胞內(nèi)cAMP或cGMP，從而終結這些第二信使所傳導的生化作用(田慧等, 2003)。Fahmin等(2017)研究顯示，PDES、二腺苷酸環(huán)化酶(DACS)和c-di-AMP合成酶構成環(huán)二腺苷單磷酸(c-di-AMP)，PDES和DACS協(xié)同調節(jié)c-di-AMP的穩(wěn)態(tài)，PDES的缺失可導致革蘭氏陽性細菌的細胞壁發(fā)生改變、鉀離子吸收失調、c-di-AMP水平改變、細菌的存活率下降。c-di-AMP在不同的細菌體內(nèi)具有不同的作用，可以影響生物膜的形成、毒力因子的表達、運動性和碳代謝(Corrigan, 2013)，但其調控細菌表型和毒力的機制尚不清楚(Pham, 2016; Corrigan, 2013)。本研究中，由于轉座子插入，使鰻弧菌的1個PDES失活，有可能影響了細菌細胞壁離子代謝和生物膜形成，而導致細菌運動能力改變，具體的影響機制還需進一步探究。

編碼異丙基蘋果酸異構酶，將-異丙基蘋果酸催化為-異丙基蘋果酸，為亮氨酸的合成提供前體(Kohlhaw, 2003)。編碼異丙基蘋果酸脫氫酶，具有N-酰基-L-高絲氨酸內(nèi)酯(AHL)降解酶活性(Ma, 2018)。AHL參加細菌密度感應系統(tǒng)(QS)的調節(jié)，調控生物膜形成(Parsek, 2000)、蛋白酶活性(Waters, 2005)等。在染色體上，位于和之間，由此推測，的插入失活間接影響了的功能，從而影響鰻弧菌QS的功能，使蛋白酶活性、生物膜形成能力受到影響。

編碼一種細胞質蛋白，與內(nèi)層錨定蛋白RseA結合，調節(jié)膜內(nèi)蛋白水解與蛋白酶活性(Kim, 2010)；編碼硫胺素ABC轉運ATP結合蛋白，參與細菌的能量代謝，該基因的缺失不僅使細菌整體的能量代謝下降，還使細菌的生長減慢，細菌生物膜合成所需的蛋白、胞外多糖等合成能力減弱(Huang, 2014)。編碼一種胞漿蛋白，參與亞精胺和腐胺的轉運(Shah, 2008)。因此，這些基因的缺失可能導致鰻弧菌多種蛋白或蛋白酶合成能力、轉運能力下降，間接影響蛋白酶的活性。這些基因對蛋白酶活性的影響機制有待闡明。

編碼乙酰乳酸合酶，催化2-乙酰乳酸的合成，參與三羧酸循環(huán)(Zhao, 2013)；編碼 2-甲基異檸檬酸裂解酶，促進2-甲基異檸檬酸酯催化丙酮酸和琥珀酸酯的形成，參與碳源合成(Hubstenberger, 2015)，說明和與ATP合成相關。因此，猜測這2個參與能量合成的基因間接影響鰻弧菌菌膜的形成，它們對菌膜形成的影響機制有待闡明。

總之，本研究通過轉座子文庫，鑒定出8個與鰻弧菌運動、胞外蛋白酶活性、菌膜形成有關的基因。由于轉座子的插入突變可能會引發(fā)極性效應，使得插入位點的下游基因受到影響。因此，后期還需要通過基因敲除、基因回補實驗來確證它們與表型變化的關系，在此基礎上研究基因的功能及作用機制。

Austin B, Alsina M, Austin DA,. Identification and typing of: A comparison of different methods. Systematic and Applied Microbiology, 1995, 18(2): 285– 302

Austin B, Austin D. Characteristics of the pathogens: Gram- negative bacteria. In: Bacterial fish pathogens. Springer Praxis Books. Springer, Dordrecht, 2007

Corrigan RM, Campeotto I, Jeganathan T,. Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110(22): 9084–9089

Croxatto A, Chalker VJ, Lauritz J,. VanT, a homologue ofLuxR, regulates serine, metalloprotease, pigment, and biofilm production in. Journal of Bacteriology, 2002, 184(6): 1617–1629

Ding S, Li SF, Li J,Long-term protection effect oftrivalent inactivated vaccine. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(5): 137–142 [丁山, 李淑芳, 李杰, 等. 鰻弧菌三價滅活疫苗的長期免疫保護效果. 漁業(yè)科學進展, 2018, 39(5): 137–142]

Fahmin T, Port GC, Cho KH. c-di-AMP: An essential molecule in the signaling pathways that regulate the viability and virulence of gram-positive bacteria. Genes (Basel), 2017, 8(8): 197

Frans I, Michiels CW, Bossier P,.as a fish pathogen: Virulence factors, diagnosis and prevention. Journal of Fish Diseases, 2011, 34(9): 643–661

Hall-Stoodley L, Costerton JW, Stoodley P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology, 2004, 2: 95–108

Hao B, Mo ZL, Xiao P,. Role of alternative sigma factor 54 (RpoN) fromM3 in protease secretion, exopolysaccharide production, biofilm formation, and virulence. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(6): 2575–2585

Herrero M, de Lorenzo V, Timmis KN. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology, 1990, 172(11): 6557–6567

Hirono I, Masuda T, Aoki T. Cloning and detection of the hemolysin gene of. Microbial Pathogenesis, 1996, 21(3): 173–182

Huang H, Tao YX. A small molecule agonistas a novel pharmacoperone for intracellularly retained melanocortin-4 receptor mutants. International Journal of Biological Sciences, 2014, 10(8): 817–24

Hubstenberger A, Cameron C, Noble SL,. Modifiers of solid RNP granules control normal RNP dynamics and mRNA activity in early development. Journal of Cell Biology, 2015, 211(3): 703–716

Kamoun F, Fguira IB, Tounsi A,. Generation of mini-Tn10 transposon insertion mutant library offor the investigation of genes required for its bacteriocin production. FEMS Microbiology Letters, 2009, 294(2): 141–149

Kim DY, Kwon E, Choi JK,. Structural basis for the negative regulation of bacterial stress response by RseB. Protein Science, 2010, 19(6): 1258–1263

Kohlhaw GB. Leucine biosynthesis in fungi: Entering metabolism through the back door. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2003, 67(1): 1–15

Lazarevic V, Soldo B, Médico N,.-phosphoglucomutase is required for normal cell morphology and biofilm formation. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(1): 39–45

Lee C, Lee S, Shin SG,. Real-time PCR determination of rRNA gene copy number: Absolute and relative quantification assays with. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 78(2): 371–376

Lindell K, Fahlgren A, Hjerde E,. Lipopolysaccharide O-antigen prevents phagocytosis ofby rainbow trout () skin epithelial cells. PLoS One, 2012, 7(5): e37678

Ma H, Wang X, Zhang Y,. The diversity, distribution and function of N-acyl-homoserine lactone (AHL) in industrial anaerobic granular sludge. Bioresource Technology, 2018, 247: 116–124

Milton DL, O'Toole R, H?rstedt P,. Flagellin A is essential for the virulence of. Journal of Bacteriology, 1996, 178(5): 1310–1319

Mo ZL, Guo DS, Mao YX,. Identification and characterization of thegene encoding a new metalloprotease. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2010, 28(1): 55–61

Naka H, Crosa JH. Genetic determinants of virulence in the marine fish pathogen. Fish Pathology, 2011, 46(1): 1–10

Norqvist A, Norrman B, Wolf-Watz H. Identification and characterization of a zinc metalloprotease associated with invasion by the fish pathogen. Infection and Immunity, 1990, 58(11): 3731–3736

Ormonde P, H?rstedt P, O'Toole R,. Role of motility in adherence to and invasion of a fish cell line by. Journal of Bacteriology, 2000, 182(8): 2326– 2328

O'Toole R, Milton DL, Wolf-Watz H. Chemotactic motility is required for invasion of the host by the fish pathogen. Molecular Microbiology, 1996, 19(3): 625– 637

Parsek MR, Greenberg EP. Acyl-homoserine lactone quorum sensing in gram-negative bacteria: A signaling mechanism involved in associations with higher organisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(16): 8789–8793

Pham TH, Liang ZX, Marcellin E,. Replenishing the cyclic-di-AMP pool: Regulation of diadenylate cyclase activity in bacteria. Current Genetics, 2016, 62(4): 731–738

Schaber JA, Carty NL, McDonald NA,. Analysis of quorum sensing-deficient clinical isolates of. Journal of Medical Microbiology, 2004, 53(Pt 9): 841–853

Shah P, Swiatlo E. A multifaceted role for polyamines in bacterial pathogens. Molecular Microbiology, 2008, 68(1): 4–16

Stewart PS, Costerton JW. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. The LANCET, 2001, 358(9276): 135–138

Tian H, Zhang Q, Zhu JS. New phosphodiesterase and its new function. Chinese Journal of Clinical Pharmacology, 2003, 19(6): 458–460 [田慧, 張奇, 朱景申. 新的磷酸二酯酶及其功能. 中國臨床藥理學雜志, 2003, 19(6): 458–460]

Waters CM, Bassler BL. Quorum sensing: Cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology, 2005, 21: 319–346

Weber B, Hasic M, Chen C,. Type Ⅵ secretion modulates quorum sensing and stress response in. Environmental Microbiology, 2009, 11(12): 3018–3028

Wilhelm S, Gdynia A, Tielen P,. The autotransporter esterase EstA ofis required for rhamnolipid production, cell motility, and biofilm formation. Journal of Bacteriology, 2007, 189(18): 6695–6703

Wilson AC, Perego M, Hoch JA. New transposon delivery plasmids for insertional mutagenesis in. Journal of Microbiological Methods, 2007, 71(3): 332–335

Xie C, Zhang B, Wang D,. Molecular cloning and characterization of an achene-seed-specific promoter from motherwort (Houtt). Biotechnology Letters, 2011, 33(1): 167–172

Yang MC. Veterinary statistics. Beijing: China Prospect Press, 1990 [楊茂成. 獸醫(yī)統(tǒng)計學. 北京: 中國展望出版社, 1990]

Zhao Y, Niu C, Wen X,. The minimum activation peptide fromcan activate the catalytic subunit of AHAS from different species. Chembiochem, 2013, 14(6): 746–752

Zhou MY, Wang GL, Li D,. Diversity of both the cultivable protease-producing bacteria and bacterial extracellular proteases in the coastal sediments of King George Island, Antarctica. PLoS One, 2013, 8(11): e79668

Construction of A mini-Tn10 Transposon Library to Identify Genes Associated with Several Phenotypes ofM3

LI Qian1, LI Guiyang2, LI Jie2, MO Zhaolan1,2①

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Yellow SeaFisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao),Qingdao 266071)

The phenotypic characteristics ofare related to the pathogenicity of the bacteria, such as swimming motion, ability of membrane formation, and extracellular protease production. To identify the genes affecting phenotypic changes in, this study used transposon mini-Tn10 (pLOF/Kana) to construct a library ofM3 mutant strains and to screen the strains and related genes that affect phenotypic changes. It is proved that there is a certain correlation between mutants causing these phenotypic changes and the virulence. Mutations of 1152 strains of M3 mutant library were screened, and mutant strains with significant changes in swimming ability (strain 6G_1), casein enzyme activity (strains 5A_11, 7B_12, and 7E_12), gelatin enzyme activity (strain 7H_1), and biofilm formation ability (strains 5E_2, 6A_2, and 6E_12) were noted. Further analysis revealed that a phosphodiesterase-related gene mutation caused increased swimming capacity (<0.05),,, andmutations caused a significant decrease in caseinase activity (<0.05), andmutations caused a significant decrease in gelatinase activity (<0.05). Moreover, mutations in,andresulted in a significant decrease in the ability to form bacterial membranes (<0.05). Moreover, we observed a virulent infection in these mutant strains, which showed that LD50of wild type M3 was 2.04 times higher than that of 6G_1 and the virulence was relatively increased. Additionally, 5A_11, 7B_12, and 7E_12 LD50were 2.96 times, 3.25 times, and 3.36 times higher than that of wild-type M3, respectively. The LD50with the strain 7H_1 was 1.25 times higher than that of wild M3, and the LD50with the strains 5E_2, 6A_2, and 6E_12 were 3.34, 4.08, and 1.84 times higher than that of wild M3, respectively. These results lay a foundation for further study on the pathogenic mechanism of.

; mini-Tn10 transposon; Mutant library; Phenotype; Gene

MO Zhaolan, E-mail: mozl@ysfri.ac.cn

S917.1

A

2095-9869(2020)05-0019-08

10.19663/j.issn2095-9869.20190426001

http://www.yykxjz.cn/

李倩, 李貴陽, 李杰, 莫照蘭. 利用mini-Tn10轉座子文庫篩選鰻弧菌M3表型發(fā)生變化的基因. 漁業(yè)科學進展, 2020, 41(5): 160–167

Li Q, Li GY, Li J, Mo ZL. Construction of a mini-Tn10 transposon library to identify genes associated with several phenotypes ofM3. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(5): 160–167

* 國家重點研發(fā)計劃(2018YFC0311300)、國家自然科學基金——山東省人民政府聯(lián)合基金(U1706205)、中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務費(20603022017008)和鰲山科技創(chuàng)新計劃(2015ASKJ02)共同資助[This work was supported by National Key Research and Development Program of China (2018YFC0311300), NFSC-Shandong Joint Fund (U1706205), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS (20603022017008), and Aoshan Technology Innovation Program (2015ASKJ02)]. 李 倩，E-mail: 840373607@qq.com

莫照蘭，研究員，E-mail: mozl@ysfri.ac.cn

2019-04-26,

2019-07-02

(編輯 馬璀艷)