應用頂空-毛細管柱氣相色譜法測定一次性無菌氣管插管環氧乙烷殘留量的研究

李平 王野 吳永芝

(天津美迪斯醫療用品有限公司，天津 300385)

氣管插管用于插入患者氣管和（或）支氣管，為患者特別是不能自主呼吸或者手術中需要呼吸麻醉的患者創建一個臨時性的人工呼吸通道。氣管插管通常頭部有一個或兩個套囊，套囊充起后可以起到固定插管和密封氣道的作用，防止異物進入呼吸道，保持呼吸道通暢，進行有效的人工或機械通氣。插管管身通常由高分子材料制成，管身內埋有鋼絲線圈，以提高徑向強度和軸向柔軟度。按照國家藥品監督管理局2017年發布的《醫療器械分類目錄》，氣管插管歸為“08-06呼吸、麻醉用管路、面罩”中的“03氣管內插管/氣管套管”，屬于Ⅱ類醫療器械，要求無菌提供，一次性使用。

醫療器械常用的滅菌方式主要干熱、濕熱、環氧乙烷(Ethylene Oxide,EO)、輻照等。EO氣體及其混合物作為一種有效的滅菌劑，主要用于不能進行濕熱滅菌的醫療器械，即畏濕、畏熱的醫療器械[1]。氣管插管多使用PVC等醫用高分子材料，受其耐受性等因素影響，現廣泛使用EO滅菌。EO作為一種廣譜低溫滅菌劑，其作用原理是烷基化，通過對細胞中DNA、蛋白質（酶）等分子的不可逆作用導致分子功能喪失，細胞不再復制，繼而死亡。其大量殘留對人體具有遺傳毒性、生殖毒性、致癌性等問題[2]，因而為了避免對使用者的身體造成傷害，檢測EO殘留量具有重要意義。

國家對經EO滅菌的一次性醫療用品出廠具有嚴格規定，即EO殘留量不大于10μg/g[3]。EO殘留檢測方法根據GB/T14233.1-2008[4]有比色分析法和氣相色譜法兩種，而后者檢測具有較強的選擇性，且具有不受被測樣品的成分和性質干擾的特點，適合各種材質醫療器械的EO殘留測定[5]。目前，一次性無菌氣管插管多采用填充柱氣相色譜法，手工進樣、柱效低、檢出限較高[6]。本研究采用頂空-毛細管柱氣相色譜法檢測EO，簡單、準確、快速，檢出限低，精密度和準確度良好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

氣相色譜儀：島津氣相色譜儀GC2014C，火焰離子檢測器(FID)；HS-10頂空進樣器；色譜柱：毛細管柱Inert Cap 624，長度×直徑×膜厚=30.0m×0.25mm×1.4μm。

1.2 試藥

1.2.1 標準樣品的配制

EO標準品(o2si smart solutions，上海安譜實驗科技股份有限公司，Lot No.318517&373149)，濃度10000mg/L；稀釋用水為滅菌注射用水（石家莊四藥有限公司）；20ml頂空瓶及丁基頂空瓶蓋。

1.2.2 一次性無菌氣管插管

天津美迪斯醫療用品有限公司生產，ETT-X32-65，批號：20191213。

1.2.3 樣品制備[7]

一次性無菌氣管插管，主要由帶囊管體、氣源接頭、單向閥或壓力指示器等構成。樣品制備選取與人體接觸部分，按照要求采用極限浸提方法中的熱浸提方法。

2 實驗部分

2.1 色譜條件

氣化室溫度120℃，載氣為氮氣，分配比10，流量1.2mL/min，色譜柱溫100 ℃，檢測器溫度160℃。按外標法以峰面積計算EO的含量。

2.2 正交實驗

2.2.1 正交實驗設計

根據GB/T9722-2006[8]，考慮EO本身的物化性質及所選氣相色譜儀的特點等因素，主要選取樣品提取的平衡溫度、平衡時間和攪拌這3個因素。為了選擇出檢測EO的最佳實驗條件，正交設計三水平三因素實驗，采用正交表L9（34）安排實驗，見表1。

表1 正交實驗因素水平

2.2.2 正交實驗結果及分析

實驗結果數據見表2。從極差可以看出，對峰面積影響的因素主次順序是A →B →C；從方差分析得出A在顯著性水平α=0.10上是顯著的。由此可以確定樣品預處理的方法是頂空瓶平衡溫度為80℃，平衡時間15min，無需攪拌。

3 驗證部分[6,9-10]

按照優化實驗參數，取平衡溫度80℃，平衡時間15min，完成以下實驗。

3.1 線性范圍、回歸方程和檢出限

配制1～20μg/ml共7個濃度的標準溶液，精確量取5ml置于20ml頂空瓶中密封，按上述色譜條件測定峰面積。以EO標準液的濃度（μg/ml）為橫坐標，以對應的峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線。

EO濃度在5～100μg線性關系良好，相關系數為0.9998，回歸方程為Y=8537.28X-2363.41。檢出限按3倍基線噪音計算為0.06μg/ml。

表2 正交實驗L9 (34)結果數據及極差分析、方差分析計算

3.2 專屬性實驗[11]

取未經EO滅菌的氣管插管，剪成5mm的碎片，精密稱取1.00g，放入20ml的頂空瓶中加8μg/ml的EO溶液5ml，密封后放入頂空進樣器。用10μg/ml的EO溶液作為對照液，按照上述色譜條件測定，未經滅菌的氣管插管如有雜質峰，應與EO峰基線分離，分離度R＞1.5。樣品圖譜見圖1、圖2。

由圖1可得，未經EO滅菌的樣品圖譜無雜峰出現，與圖2中8μg/mL的EO溶液對照品對比，結果明顯，符合檢定標準。

圖1 未經環氧乙烷滅菌的樣品圖譜

3.3 準確度或回收率實驗

精密稱定EO適量，配制濃度為約4.8μg/mL、9.9μg/mL、19.8μg/mL的EO溶液各3份，分別按上述氣相色譜方法測定，計算回收率，即測得值除以加入量。通過回收率高低判斷準確度。回收率（%）=測得量/加入量×100%。回收率平均值應在90%～110%之間（n ≥9，至少3個濃度，每個濃度3份樣品），相對標準偏差應≤5%（n ≥9，至少3個濃度，每個濃度3份樣品）。EO溶液準確度試驗數據見表3。

結果表明，按照上述色譜條件測定，3個標準樣品的EO平均濃度分別為4.806μg/ml、10.023μg/ml和20.082μg/ml，相對標準偏差分別為0.32%、2.36%和2.14%。符合要求。

圖2 8μg/mL環氧乙烷溶液圖譜

表3 EO溶液準確度試驗數據

3.4 精密度試驗

分別取3個濃度的EO溶液5ml于頂空瓶中，連續進行6次測定，計算相對標準偏差。由相對標準偏差分析精密度，當≤5%時，表明精密度良好。結果見表4。

結果表明，按照上述色譜條件測定，3個EO的平均濃度分別為2.56μg/ml、5.69μg/ml和11.70μg/ml，相對標準偏差分別為0.74%、1.77%和2.54%，＜5%。該方法的精密度良好。

3.5 樣品EO殘留量試驗

選取樣品中與人體接觸部分進行實驗，將其截為5mm的碎片，精密稱取1.0000g，放入20mL的頂空瓶中精密加水5mL，使樣品充分浸泡在水中，密封后放入頂空進樣器。EO測量結果按式（1）計算[7]。

上式中，CEO：產品中EO相對含量，μg/g；5：量取的浸提液體積，ml；c：標準曲線上得到的樣品試液相應的濃度，μg/g；m：稱樣量，g。

樣品EO殘留量測定結果見表5。

4 討論

氣相色譜法相較于比色分析法測試EO，具有機械性高、重復性好等特點，漸漸成為各醫療器械單位的首選，但也提出了更高的技術要求。儀器的選擇方面，該實驗沒有選擇頂空手動進樣，因為EO的易揮發性易造成精密度不高和結果不準確的情況。本實驗采用頂空自動進樣器，表現出了良好的精密度。另外，色譜柱選擇中多推薦填充柱，但本實驗中考慮到毛細管柱的普及性、使用方便、柱效高、靈敏度高等特點，選擇的毛細管柱Inert Cap 624是中等極性氣相毛細管色譜柱，適合于極性較小的EO。

表5 樣品EO殘留量

在方法學建立方面，氣相色譜檢測過程中其設定的操作參數較多，不僅僅需要確定檢測參數，而且需要針對不同的醫療器械確定不同的前處理參數，包括平衡時間、平衡溫度、攪拌頻率等。正交實驗是處理多因素實驗中比較常用且較為科學的方法，各個因素之間具有均勻分散和整齊可比的特點。相比較于單因素優選法，正交實驗法更具有代表性，容易區分因素影響的主次順序，用較少的試驗次數獲得各因素對效應指標的影響，通過數理統計方法對實驗結果進行分析，獲取最佳或者較理想的實驗條件或參數[12]，縮短了樣品檢測周期和條件優化時間，更加適合實際應用。本文通過正交試驗建立氣相色譜法測定EO的方法，希望能為其他醫療器械單位的檢測方法確立提供參考，保證快速、高效、準確地檢測出EO殘留量，確保相關一次性使用無菌醫療器械的安全性。

此次實驗使用正交實驗的方法，對峰面積進行量化評價，通過極差分析和方差分析計算，最佳水平組合為A3B1C1，即平衡溫度80℃，平衡時間15min，無需攪拌。繼而，根據選定參數進行線性試驗、準確度試驗、精密度試驗等，證明該法靈敏度高、精密度和準確度良好，能夠用于一次性無菌氣管插管的EO殘留量檢測。