結核菌素試驗在四川省布拖縣HIV感染/AIDS患者中篩查結核感染的價值

李婷 何金戈 蘇茜 李京 李運葵 高文鳳 高媛 楊文

結核病是HIV感染與AIDS患者最常見的機會性感染和最主要的死亡原因之一[1]，2018年全球有86.2萬例新發結核病患者并發HIV感染，25.1萬例結核病死亡患者為HIV感染者[2]，且有30%～60%的HIV感染/AIDS死亡者可能生前未進行過結核病診斷[3]。因此，HIV感染/AIDS患者并發結核感染已成為全球及我國重要的公共衛生問題，如何切實有效地發現HIV感染/AIDS患者并發結核感染，降低該人群病死率，已成為一項亟需探討的重要課題。結核菌素純蛋白衍生物(purification protein of tuberculosis，PPD)試驗是一種輔助診斷結核病的常用和傳統方法，也是檢測潛伏性結核感染(latent tuberculosis infection, LTBI)的經典方法[4-5]，但其檢測HIV感染/AIDS患者中結核感染的敏感度與特異度還有待進一步評價，尤其缺乏大樣本的研究結果支撐。為進一步了解PPD試驗在該人群中的篩查價值，以及與該人群并發活動性肺結核的關系，本研究在‘十三五’國家科技重大專項研究的基礎上，首次在涼山彝族自治州(簡稱“涼山州”)HIV感染/AIDS患者中開展結核病篩查的大規模橫斷面調查研究，旨在為HIV感染/AIDS患者并發結核感染的進一步研究提供科學依據。

資料和方法

一、研究對象

2016年以來，“‘十三五’國家科技重大專項——涼山州布拖縣艾滋病綜合防治示范區規模化現場隊列研究”已準確掌握布拖縣九都鄉、木爾鄉、特木里鎮(簡稱“兩鄉一鎮”)約3萬名人口的健康體檢檔案信息及HIV感染狀況，發現并管理2159例HIV感染/AIDS患者。本研究于2018年12月至2019年8月，從上述管理患者中納入可隨訪且已接受免疫抑制劑治療>1個月的688例患者開展結核病現場篩查和全血CD4+T淋巴細胞計數檢測，對符合條件者進行MTB病原學檢測。

排除175例未進行PPD試驗結果核驗、40例未行胸片檢查且無結核病病原學診斷依據和7例非結核分枝桿菌感染的患者后，最終納入466例患者；其中男237例，女229例；年齡2～70歲，中位年齡為37歲；463例(99.36%)患者為彝族。統計PPD試驗結果及專家組根據PPD實驗結果及其他臨床資料判定的活動性肺結核或LTBI情況，繼而分析PPD試驗對活動性肺結核的檢測效能及其陽性率與不同CD4+T淋巴細胞計數患者間的關系。所有患者在現場篩查和資料采集前均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.結核病現場篩查程序：本研究在布拖縣人民醫院開展集中現場篩查。包括對全部調查對象進行問卷調查[包括患者基本信息(性別、年齡、職業、婚姻狀況)、結核病可疑癥狀(包括咳嗽、咳痰持續2周以上，反復咳出帶血的痰，反復發熱持續2周以上，夜間經常出汗，無法解釋的體質量明顯下降，經常容易疲勞或呼吸短促，淋巴結腫大)、既往史、結核病病史、HIV感染途徑等]、PPD試驗、胸部X線攝影(簡稱“胸片”)檢查及血CD4+T淋巴細胞計數檢測。對符合下列條件的被調查者可在現場留取即時痰，在72 h查驗PPD試驗結果時回收晨痰和夜痰進行MTB病原學檢測：(1)具有任意一項肺結核可疑癥狀者。(2)胸片顯示肺結核病變或疑似結核病變者。(3)已知活動性肺結核患者但胸片未見異常者。(4)確實不能參加胸片檢查的調查對象(行動不便者、孕婦等)。以上調查和檢查結果均填寫在體檢表中。

2.結核病分類及診斷：(1)根據《WS 196—2017結核病分類》[6]將結核病分為LTBI、活動性結核病、非活動性結核病。(2)病原學陽性為痰涂片萋-尼(Z-N)染色鏡檢、分枝桿菌固體培養或環介導等溫擴增法分子生物學快速檢測任一陽性。(3)按照《WS 288—2017 肺結核診斷》[7]標準，本研究由臨床診斷專家組經集體討論確定活動性肺結核和LTBI。

3.問卷調查：由經過培訓的可使用彝漢雙語的布拖縣醫院和“兩鄉一鎮”的鄉鎮衛生院醫務人員作為調查員開展一對一詢問式問卷調查。結核病可疑癥狀問卷內容與《結核桿菌/艾滋病病毒雙重感染防治工作技術指導手冊》[8]一致。共計發出問卷688份，收回有效問卷688份，有效率為100.0%。

4.PPD試驗方法及結果判定：在調查對象左前臂掌側前1/3中央皮內注射0.1 ml(5 IU)TB-PPD試劑(北京祥瑞生物制品有限公司生產)，72 h后查驗皮膚試驗反應，測量注射部位硬結平均直徑[(橫徑+縱徑)/2]大小及觀察注射部位有無雙圈、水皰、壞死及淋巴管炎等強陽性反應。PPD試驗結果分為陰性(硬結平均直徑<5 mm或無反應者)、一般陽性(硬結平均直徑<10 mm但≥5 mm)、中度陽性(硬結平均直徑<15 mm但≥10 mm)和強陽性(硬結平均直徑≥15 mm或局部出現雙圈、水皰、壞死及淋巴管炎者)。由于調查對象均為HIV感染/AIDS且接受免疫抑制劑治療>1個月的患者，本研究將一般陽性及以上視為PPD試驗陽性及結核感染[7]；將僅PPD試驗陽性但缺乏病原學和活動性肺結核影像學證據者視為LTBI；將PPD試驗陽性且符合活動性肺結核影像學改變者視為活動性肺結核。

5.CD4+T淋巴細胞計數和分級：采集患者抗凝全血，24 h內使用美國BD公司FACSCalibur流式細胞儀檢測CD4+T淋巴細胞計數。根據《WS 293—2019艾滋病和艾滋病病毒感染診斷》[9]中CD4+T淋巴細胞計數的分級情況，將CD4+T淋巴細胞計數分為4個層次，分別為≥500個/μl(提示無免疫缺陷)、350～499個/μl(提示輕度免疫缺陷)、200～349個/μl(提示中度免疫缺陷)、<200個/μl(提示重度免疫缺陷)。

6.質量控制：制定實施細則；由國家級和省級專家對參加現場篩查的工作人員進行統一培訓，嚴格按照操作規范進行；問卷調查采用一對一的面對面詢問方式，篩查項目由調查員引領調查對象進行檢查，核實問卷及體檢表后回收并發放交通補助；省級工作人員作為質控人員全程參與并立即核查每天收回后的問卷及體檢表有無邏輯錯誤和(或)漏項，核實無誤后及時錄入并妥善保存體檢表；篩查發現的所有疑似結核病患者，報國家級、省級專家組確認；前期通過預調查10例符合條件患者來修訂調查程序。

三、統計學處理

采用 Excel 2010和SPSS 21.0軟件進行數據的錄入和統計學分析。以專家組確診的活動性肺結核為參考標準，評價PPD試驗對活動性肺結核的檢測效能(包括敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和一致率指標)。計數資料采用χ2檢驗或連續校正χ2檢驗(理論頻數<5且≥1時)，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、PPD試驗檢測結果

466例患者中，PPD試驗陰性者377例(80.90%)、一般陽性者14例(3.00%)、中度陽性者29例(6.23%)、強陽性者46例(9.87%)，陽性率為19.10%(89/466)，89例陽性者(一般陽性及以上)均符合結核感染的診斷。

二、PPD試驗對活動性肺結核的檢測效能

466例患者經結核病篩查程序和專家定診，確定89例為并發活動性肺結核，377例為未并發患者，并發率為19.10%；確定LTBI患者57例，檢出率為12.23%(57/466)。以專家組確診的活動性肺結核作為參考標準，PPD試驗檢測活動性肺結核的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和一致率見表1。

表1 以專家組確診的活動性肺結核為參考標準評估PPD試驗對活動性肺結核的檢測效能

三、PPD試驗結果與是否并發活動性肺結核及CD4+T淋巴細胞計數水平的關系

PPD試驗陽性率在并發與未并發活動性肺結核患者中的差異有統計學意義(P=0.000)，見表2。對本研究有CD4+T淋巴細胞計數檢測結果的409例患者進行分析，顯示并發活動性肺結核患者的PPD陽性率均高于未并發者，但僅在CD4+T淋巴細胞計數≥500個/μl時差異有統計學意義(表3)。同時發現未并發活動性肺結核患者的PPD陽性率在不同CD4+T淋巴細胞計數下的差異無統計學意義(χ2=4.291，P=0.232)；而并發活動性肺結核患者上述指標的差異有統計學意義(χ2=5.024，P=0.025)且呈遞增趨勢，見表3。

表2 并發和未并發活動性肺結核患者的PPD試驗結果及陽性率的比較

表3 不同CD4+ T淋巴細胞計數在并發與未并發活動性肺結核患者PPD 試驗結果中的分布

討 論

四川省涼山州是我國最大的彝族聚居區，位于四川省和云南省交界處，由于社會經濟文化落后、特有的民風民俗致傳染病多發，是結核病、AIDS高負擔地區[10]。布拖縣位于涼山州東南部，彝族人口占95%，長期處于AIDS高流行狀態，“兩鄉一鎮”的HIV感染率在全縣較高，MTB/HIV雙重感染一直是當地公共衛生防控難點。

既往研究發現，四川省肺結核患者中的HIV感染陽性檢出率高于北京、廣東、河南、河北等地的研究結果，且彝族患者的檢出率明顯高于漢族[11]。本研究結果顯示，HIV感染/AIDS患者中活動性肺結核的檢出率為19.10%，遠高于2006—2007年河南、四川、云南和廣西四省(自治區)中6個艾滋病高疫情縣的檢出率(6.4%)[12]和2012 年重慶市的檢出率(1.09%)[13]，考慮可能與本次調查是對管理的HIV感染/AIDS患者的集中篩查，且篩查程序較為完善，并由專家組綜合臨床診斷路徑和實驗室方法進行診斷有關，也可能說明布拖縣MTB/HIV雙重感染疫情較其他地區嚴重。

HIV感染/AIDS患者免疫功能缺陷，其并發LTBI是開展預防性抗結核治療的必要前提，準確掌握該人群的結核感染現狀及其流行病學特征，及時診斷結核病是降低該人群并發結核病的有效手段，對臨床診治和降低病死率有著重要意義，是實現WHO “終止結核病策略”目標的重要突破口[14]，但如何確認該人群結核感染是目前最大的難題[12]。本次調查LTBI的檢出率為12.23%，低于代佳偉等[15]對云南省傳染病專科醫院121例HIV感染/AIDS患者(排除活動性肺結核后)進行PPD試驗檢測的LTBI檢出率(14.9%)，結合該研究PPD試驗陽性判定標準(硬結平均直徑≥10 mm)高于本研究標準的情況，考慮與云南省結核感染現狀較本研究更嚴重或是樣本量差異較大有關。由于在HIV感染者中，LTBI每年進展為活動性結核病的風險為7%～10%，明顯高于HIV陰性者[16]；加之Diel等[17]的研究也表明，PPD試驗陽性預示著未來有2.3%的概率會發展成為活動性結核病，故筆者建議應高度重視HIV感染/AIDS患者中的LTBI者，建議對其開展預防性干預，降低其發展為活動性肺結核的風險。近年來，γ干擾素釋放試驗(如T-SPOT.TB)被許多國家用于輔助診斷結核病及判斷LTBI，但WHO[18]認為，γ干擾素釋放試驗在敏感度和特異度方面較PPD試驗并未顯示出更明顯的優勢，建議結核病高負擔地區可以僅采用PPD試驗篩查HIV感染人群中的LTBI者。

本研究以專家組確診的活動性肺結核為參考標準，發現PPD試驗的敏感度(35.96%)僅略高于錢小軍等[19]對45例MTB/HIV雙重感染者進行PPD試驗檢測的結果(31.58%)。而且，2013年Gao等[20]在我國選擇了4個不同結核病疫情地區的農村全人口(5周歲以上)，開展了目前全球最大規模的結核感染的流行病學調查和隊列研究項目，共計篩查約22 000人，PPD試驗硬結平均直徑≥5、10、15 mm的人口比例分別為40%、28%和19%，明顯高于本研究PPD試驗3個陽性等級反應的比例(分別為19.10%、16.09%和9.87%)，進一步證實了在免疫力低下、應用免疫抑制劑、營養不良等患者中，PPD試驗的敏感度不高，存在假陰性反應較多的情況[21]；但本研究另一方面顯示，PPD試驗的檢測特異度較高(84.88%)，可認為將PPD試驗陰性者判斷為非結核感染具有較高的真實性。另外，研究還顯示，HIV感染/AIDS并發活動性肺結核患者的PPD試驗中度及以上陽性的構成比是未并發患者的兩倍以上，提示PPD試驗反應強度越大，越有可能并發活動性肺結核。

比較不同CD4+T淋巴細胞水平的HIV感染/AIDS患者并發和未并發活動性肺結核的PPD試驗結果，發現并發患者在CD4+≥500個/μl時的PPD陽性率(52.00%)明顯高于未并發患者(16.67%)，差異有統計學意義，與伊朗的一項研究結果相似[22](即CD4+≥500個/μl的MTB/HIV患者的PPD試驗陽性率高于<500個/μl者)；也與國內的多項研究結果一致，如黃勁華和李凡[23]、謝志滿等[24]的研究發現，隨著患者CD4+T淋巴細胞計數的增多，PPD陽性率也逐漸增高，且前者的研究顯示，當CD4+<200個/μl時，HIV陽性患者的PPD試驗結果均為陰性。說明HIV感染/AIDS并發活動性肺結核患者的免疫系統受損越嚴重，越不易對結核菌素發生免疫反應；而當免疫功能正常時，機體更易對PPD產生反應，致PPD試驗陽性率較高，且隨著CD4+T淋巴細胞計數的增多而增高。提示在實際工作中，當對HIV感染/AIDS患者進行PPD試驗時，應考慮到免疫力低下對PPD試驗陽性反應的影響。

綜上所述，PPD試驗檢測布拖縣HIV感染/AIDS患者是否并發活動性肺結核的敏感度不高，需與其他檢查方法聯合使用；但PPD試驗陽性率隨患者CD4+T淋巴細胞計數的增多而增高，加之特異度較高，陰性結果可提示非結核感染，仍可作為HIV感染高流行和衛生資源有限地區的有效篩查方法。此外，本研究未查驗卡痕，無法排除卡介苗接種對PPD試驗結果的影響，希望在今后的研究中予以考慮。