肉桂醛對腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織自噬的影響

周佳明 浦延鵬

1)葫蘆島市中心醫院，遼寧 葫蘆島 125003 2)錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧 錦州 121000

腦卒中是困擾全世界的疾病之一，近年來因腦卒中死亡的人數已上升到致死性疾病的首位，同時其也是造成病人殘疾的第一大致病原因[1]，缺血性腦卒中發病率約占77.8%，且治療方法有限[2]，大多以溶栓、抗凝等為主，很多西藥都具有不同的時效性及不良反應，相比較而言，中醫中藥在腦卒中的治療上，因臨床效果顯著，無不良反應等特點，而被絕大多數患者認可，廣泛應用于臨床。大腦組織在缺血再灌注后很容易發生損傷，已有相關文獻表明[3-6]這種損傷多與線粒體功能障礙、炎癥反應及神經元細胞的自噬與凋亡、BBB的滲透性等有關。LEE 等[7]通過實驗研究發現，在大鼠腦缺血性損傷后，給予肉桂的提取物治療后，能明顯減少腦梗死的面積，改善神經細胞的損傷，所以如何有效改善腦缺血再灌注后的組織損傷成為了治療的突破口，也是眾多學者們研究的熱點內容，而“自噬”在則此種腦組織損傷過程中，扮演了重要的角色，它對于腦缺血再灌注后神經細胞的“生存”與“滅亡”影響甚重，有相關文獻報道指出[8]，中藥單體及復方能有效減小組織缺血再灌注后壞死的面積，并能夠改善相應臟器的功能障礙，其治療機制可能與自噬作用的調控有關。祖國傳統醫學針對于腦梗死疾病治療的中藥藥物種類有很多，其中的桂枝、肉桂也是治療腦梗死的常用藥，主要取其溫經通脈的功用，其中桂枝氣薄，走而不守，溫通之力強，可解表散寒、化瘀通痹；而肉桂氣厚，守而不走，溫補之力強，善溫補脾腎，溫陽通痹；而肉桂醛[9-10](CA)(桂皮醛)就是從桂皮中提取的天然產物，CA的性狀呈黃色黏性液體，是樟科植物肉桂揮發油的主要成分，肉桂醛作為一種天然活性成分，具有降血糖、抗病毒和解熱鎮痛等多種藥理作用，常用于作治療血液循環障礙類疾病，疼痛及消化不良等方面[11-14]；此外因其還具有抗氧化和抗炎的特性，所以不少學者將其用于改善大鼠心、腦、腎等臟器的缺血性再灌注損傷的治療，BAE等[15]通過動物實驗發現，肉桂醛對MPTP誘導的PD小鼠模型具有神經保護作用，其作用機制可能是通過抑制神經元的死亡及細胞自噬，并且與下調P62蛋白的表達有關。而本研究主要針對大鼠腦缺血再灌注損傷機制的探析，針對肉桂醛的具體作用機制是否與自噬相關，尚未有相關文獻詳細報道，于是此次研究將通過中藥單體肉桂醛干預治療大鼠腦缺血再灌注損傷，觀察其對大鼠腦組織血流量和自噬作用的影響，探析其對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的作用機制。

1 材料與方法

1．1實驗動物及分組選擇SPF級健康成年的雄性SD大鼠50只，體質量為(280±20)g，購買于錦州醫科大學動物實驗中心(許可證編號：SCXK[遼]2014-0004)。購入后適應性飼養7 d時間，動物室溫度保持在(20±2)℃，濕度保持在45%左右，每12 h晝夜交替，給予大鼠自由飲水，常規顆粒飼料喂養，每2～3 d更換1次墊料。采用隨機數字表法將50只SD大鼠隨機分成假手術組、模型組、肉桂醛高劑量組、3-MA組、肉桂醛低劑量組，每組各10只。實驗過程中對動物的處理均遵照科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》中相關動物的實驗使用及倫理學規定。

1．2主要試劑與儀器組織自動脫水機、石蠟包埋機、生物組織攤烤片機(武漢俊杰電子有限公司)，石蠟切片機(萊卡顯微系統(上海)有限公司)，顯微鏡(尼康儀器有限公司，日本)，電泳儀及發光成像系統(Bio-Rad)，激光多普勒血流儀(moor，英國)，電熱恒溫鼓風干燥(天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司)。SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒、BCA蛋白質定量試劑盒、超敏ECL試劑盒、β-actin抗體、HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)、beclin-1(萬類生物)，LC3II抗體、p62抗體(proteintech公司)，3-Methyladenine (3-MA，T1897，50mg)購自Targetmol公司；二甲苯、無水乙醇(西隴科學股份有限公司)，甲酚紫(索萊寶)，冰醋酸(西亞試劑)。

1．3模型制備方法采用改良線栓法復制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。將SD大鼠麻醉后，用橡皮筋綁住四肢，仰臥位固定于木板自制的手術臺，分離右側頸總動脈、頸內動脈，于遠心端將頸內動脈剪個“V”型口，將磨圓滑的魚線插入2 cm，然后將魚線和頸內動脈一起結扎。1.5 h后將魚線拔出，縫合皮膚。待大鼠清醒后對其進行神經功能缺損程度的評分，參照Longa 5分制評分標準[16]進行評分，將評分為1～3分的大鼠納入實驗，未達標者排除。實驗過程中2只大鼠死亡，隨機補充。假手術組術式同上，但魚線插入深度為0.5～1 cm。

1．4干預方法肉桂醛組大鼠分別給予腹腔注射肉桂醛75 mg/(kg·d)和25 mg/(kg·d)治療，根據相關的實驗研究選擇肉桂醛的治療劑量[17]，3-MA組：于造模前1 h腹腔注射3-MA(10 mg/kg)，造模成功后與假手術組和模型組一起，每天腹腔注射與高劑量肉桂醛組相同劑量的生理鹽水，共治療7 d。

1．5指標測定

1．5．1 各組大鼠治療前后神經缺損評分變化：參照LONGA等[16]評價方法，對各組大鼠在治療前后分別行神經功能缺損評分，并作比較。

1．5．2 大鼠腦血流速度檢測：治療7 d后，用一次性注射器將20%烏拉坦(5 mL/kg)，由腹腔注入，以麻醉大鼠，然后將其固定在ST-3ND型定位儀上，暴露出顱骨冠狀縫和矢狀縫，取冠狀縫下3 cm，矢狀縫右旁開2 cm處骨鉆，打開硬質骨及硬腦膜，暴露軟腦膜，開顱出直徑約1 cm的“窗口”。將激光多普勒血流儀探針頭固定在支架上，讓探頭以均等力度接觸到軟腦膜上，然后用計算機連續記錄血流量及血流速度。

1．5．3 尼氏染色：于治療干預7 d后，各組隨機抽取3只大鼠腹腔麻醉，迅速斷頭取腦置于4%多聚甲醛中固定，經脫水、石蠟包埋后進行切片，然后用1%焦油紫或1%硫堇染色1 h。蒸餾水清洗，70%酒精分色數秒至數分鐘，依次經70%酒精、80%酒精、95%酒精，各2 min脫水，無水乙醇2次，每次5 min。二甲苯2次，每次10 min，然后脫水透明封片，用拍照顯微鏡對大鼠左側大腦皮質缺血區進行拍照觀察計數，尼氏體呈紫色、細胞核呈淡紫色。

1．5．4 Western blot法檢測大鼠腦組織自噬相關蛋白Beclin1、LC3II、P62的表達：在各組大鼠再灌注7 d后，隨機選取3只腹腔麻醉，迅速斷頭取腦，取皮層缺血區腦組織制備蛋白樣本，用BCA法檢定量各樣本組蛋白，采用12%的SDS-PAGE凝膠，取30 μg蛋白樣品，電泳后采用0.22 μm的PVDF膜進行蛋白轉印，電泳及轉膜系統購自Bio-Rad。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后一抗(1∶500)于4 ℃搖床里孵育過夜，用TBST洗膜3次(10 min/次)后將PVDF膜封入二抗稀釋液(1∶2 000)中，室溫搖床孵育2 h，再用TBST洗膜3次(10 min/次)后在PVDF膜上滴加ECL顯影液，以化學發光成像系統(Bio-Rad，USA)曝光成像，上述實驗重復3次，以β-actin作為內參，用Image J軟件進行灰度值分析。

2 結果

2．1各組大鼠神經功能評分比較假手術組大鼠未出現神經功能障礙的表現，而模型組大鼠則出現不同的神經功能障礙。7 d后，統計結果發現，與模型組比較，肉桂醛高劑量組大鼠神經功能缺損評分下降明顯，抑制劑組評分亦下降，各組差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01Figure 1 Comparison of neurological deficit scores of rats in each group．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

2．2各組大鼠腦組織血流的變化各組大鼠7 d后大腦皮質組織血流量變化如圖2所示，與假手術組比較，模型組大鼠腦血流量明顯減少(P<0.01)；與模型組比較：肉桂醛高劑量組和3-MA組血流量及速度均明顯增加(P<0.01)。

圖2 各組大鼠腦缺血再灌注后7 d大腦皮質血流量的影響及速度 與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01Figure 2 The influence and velocity of cerebral cortex blood flow 7 days after cerebral ischemia reperfusion in each group of rats．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

2．3各組大鼠缺血側大腦皮質尼氏染色比較尼氏小體是神經元體內嗜堿性顆粒，當神經元功能正常時，其結構較固定，當神經元受損時，尼氏小體會減少甚至溶解，因此可通過尼氏染色觀察尼氏小體的狀態判斷腦組織缺血側神經損傷的情況，通過鏡下觀察發現假手術組缺血側大腦皮質神經元細胞尼氏小體(呈紫色、細胞核呈淡紫色)結構完整，細胞呈多角形，模型組可見尼氏小體數量減少，肉桂醛高劑量組和3-MA組尼氏小體的數量較模型組多(P<0.01)。見圖3、4。

注：1(假手術)、2(模型組)、3(肉桂醛高劑量組)、4(3-MA組)、5(肉桂醛低劑量組)×200倍鏡下拍照，標尺=100 μm

2．4各組大鼠缺血側腦組織自噬相關蛋白beclin1、LC3II、P62的表達與假手術組相比，模型組beclin1和LC3II蛋白表達水平升高，而p62表達水平降低(**P<0.05)，與模型組比較，肉桂醛高劑量組和3-MA組beclin1、LC3II蛋白表達水平明顯減少，而p62的表達水平明顯增多(##P<0.05)。

圖4 各組尼氏體數量比較 與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01Figure 4 Comparison of the number of Nissl bodies in each group．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

圖5 各組大鼠腦組織自噬相關蛋白的表達與假手術比較，**P<0.05；與模型組比較，##P<0.05Figure 5 The expression of autophagy-related proteins in the brain tissue of rats in each group．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

3 討論

隨著時代的發展，生活水平的不斷提高，人們不良的生活及飲食習慣亦日漸增多，與此同時，如高血脂、高血壓、糖尿病等代謝性疾病的發病亦呈增高的趨勢，由此類基礎疾病所導致的患者腦梗死發病率也逐年升高，嚴重威脅人類的健康，又因該病具有高致殘率和病死率的特點，遂被專家、學者們持續的關注和研究[17-18]。近期有相關文獻研究發現[19]，腦缺血再灌注所致的神經功能損傷及細胞凋亡與自噬密切相關，當發生腦缺血再灌注損傷后，機體會發動自噬作用來清除受損的細胞器，以發揮腦保護作用；因自噬作用是一種自我降解和清除的動態過程，當機體受到外界的刺激導致細胞器受損時，就會激活自噬作用以降解受損細胞器和清除蛋白質[20]。據相關文獻報道稱中藥可以抑制神經元的過度自噬而改善缺血再灌注后相應臟器功能的恢復[10]，而“自噬”作為腦缺血再灌注損傷中重要的病理變化之一，現已經成為學者們探究的熱點內容[21-22]，自噬主要分為三大類型：微自噬、巨自噬、分子伴侶介導的自噬，而巨自噬就是通常所說的“自噬”，主要過程為誘導自噬、自噬體形成、自噬體與溶酶體融合及內容物降解。在整個自噬作用的過程中，LC3II是生成自噬體膜的必備物質，是自噬體形成的最重要分子[23]；而P62作為自噬底物蛋白，憑借在C端與泛素化蛋白結合，和在N端與LC3-Ⅱ相結合，參與整個自噬的降解[24]。因此，我們選用LC3II和P62兩個指標的表達來反映自噬作用。此外在自噬體形成的初始階段，Beclin1與Ⅲ型PI3K、p150結合形成Ⅲ型PI3K復合體，作為該復合物的中心蛋白，主要發揮促使自噬體成熟的作用[25]，然后Beclin1還能與Atg1及Atg9一同作用，共同參與調控吞噬泡的形成，最終促進自噬的發生[26]，所以本次研究選擇檢測LC3II、Beclin1和P62的表達來指示自噬通量。而3-MA則是針對自噬作用常用的一種抑制劑，廣泛用于自噬誘導的研究中，因此我們選用3-MA作為陽性對照，來比較和探究肉桂醛對腦缺血再灌注損傷的大鼠腦組織的保護作用是否與自噬作用相關。

本次研究主要觀察肉桂醛對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的治療作用，通過藥物治療干預后，分析大鼠神經功能評分、腦血流的改變以及腦組織尼氏染色和自噬相關蛋白的表達，最終得出這樣的結果，大鼠腦缺血再灌注損傷在肉桂醛進行治療干預后，大鼠的神經功能得到明顯改善，于此同時與模型組比較，自噬相關蛋白Beclin1、LC3II蛋白表達水平明顯減少，而P62的表達水平明顯增多，說明自噬作用被抑制，由此可以得出這樣的推論，肉桂醛能夠改善腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的神經功能，且高劑量組效果最為顯著，其具體的作用機制可能是通過抑制自噬作用而發揮療效的。