枳實藥材的色譜-質譜聯用指紋圖譜

陳 鑫，陳玉宇

(泰州醫藥高新技術產業園區管理委員會，江蘇 泰州 225300)

枳實為蕓香科植物酸橙及其栽培變種或甜橙的干燥幼果[1]，植物形態為常綠小喬木，有長刺。單葉互生，革質，葉柄有狹長形或倒心臟形的翼；葉片長橢圓形，有半透明油點；花排列成總狀花序；花萼杯狀，5裂；花瓣5，白色，長橢圓形；柑果圓形而稍扁，成熟時橙黃色。花期4～5月，果期6～11月。枳實呈半球形，少數為球形，直徑0.5～2.5 cm。外果皮黑綠色或暗棕綠色，具顆粒狀突起和皺紋，有明顯的花柱殘跡或果梗痕，切面中果皮略隆起，厚0.3～1.2 cm，黃白色或黃褐色，邊緣有1～2列油室，瓤囊棕褐色，質地堅硬。氣清香，味苦、微酸。主產于四川、江西、福建、江蘇等地，具有破氣消積、化痰散痞等功效。主要用于積滯內停，痞滿脹痛，瀉痢后重，大便不通，痰滯氣阻，胸痹，結胸，臟器下垂等。目前，對于枳實藥材的研究，雖然除了對于主要化學成分的含量測定以外，也包含大量的HPLC圖譜研究和其他指紋圖譜，但也存在一些不足。目前已有文獻[2-17]對枳實的指紋圖譜進行研究，標定了其中一些有效成分，本文在此基礎上采用HPLC-ESI/DAD-TOF-MS聯用色譜技術建立了枳實高效液相色譜指紋圖譜，經黃酮類標準圖譜對照和HPLC-ESI/DAD-TOF-MS總離子流信息鑒定10個共有峰，進而建立了14批枳實特征色譜指紋圖譜，此方法將色譜質譜聯用技術應用在枳實的指紋圖譜分析中，方法新穎、特征峰多、信息量大的良好特點，這種相結合的分析方法是科學的、系統的、全面的，從而有利于中藥科學的質量控制，為枳實的全面研究提供參考；為該藥的進一步開發和利用提供重要參考依據和有力手段；也為全面探究枳實活性成分提供了切實的依據。本文建立的枳實藥材綜合指紋圖譜，采用相似度評價系統對不同產地不同生產廠家的枳實藥材進行了差異甄別，為鑒定枳實藥材成分差異、控制藥材質量奠定了夯實的基礎，使其生產達到規范化、穩定化、現代化，為其它天然藥物的研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

Shimadazum LC-10Advp高效液相系統；配套真空脫氣機、自動進樣器及柱溫箱；UV檢測器；LC-Solution工作站；

Agilent 1260高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器，美國Agilent；Agilent 6224 TOF-LC-MS系統，配備電噴霧離子源(ESI 源)以及Agilent MassHutter Qualitative Analysis B.04.00質譜工作站軟件，美國Agilent；AB135-S分析天平，美國梅特勒-托利多儀器有限公司；LIBROR AEU-210 1/1 萬電子天平，Japan Shimadzu；KQ-500VDB型超聲波清洗器，昆山超聲儀器廠；Beckman Avanit J-E高速離心機，美國Beckman coulter；CW130粉碎機，上海天祥健臺制藥機械有限公司；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海索譜儀器有限公司。

1.2 材 料

枳實品種如表1所示，經鑒定為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種或甜橙(CitrussinensisOsbeck.)的干燥幼果，樣本現保存于江蘇省南京市中國藥科大學。

對照品：柚皮苷(分子式C27H32O14，CAS號10236-47-2，批號：12030612)，橙皮苷(分子式C28H34O15，CAS號250-26-3，批號：12020304)，新橙皮苷(分子式C28H34O15，CAS號13241-33-3，批號：12030701)對照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司，規格均為20 mg/支，純度≥98%。

試劑：甲醇(特級純)，南京晚晴化玻儀器有限公司；乙酸(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；乙醇(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；水為純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司。

表1 不同產地及不同炮制品的枳實

2 方法與結果

2.1 色譜條件

帶有預柱的漢邦Phecda C18色譜柱(150×4.6 mm，5 μm)，流動相為2%乙酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫，洗脫程序：0～10 min (5%～15% B, 95%～85% A)，10～15 min (15%～20% B, 85%～80% A)，15～20 min (20%～30% B, 80%～70% A)，20～25 min (30%～36% B, 70%～64% A)，25～40 min (36% B, 64% A)，40～45 min (36%～65% B, 64%～35% A)，45～50 min (65%～80% B, 35%～20% A)，50～55 min (80%～95% B, 20%～5% A)，55～60 min (95% B, 5% A)，60～65 min(95%～5%B, 5%～95% A)，65～75 min (5% B, 95% A)；流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長283 nm；進樣量10 μL；分析時間為75 min。

2.2 質譜條件

電噴霧(ESI)離子源；采用正離子和負離子模式檢測；脫氣溶劑氣流量8 L·min-1；脫氣溶劑溫度350 ℃；霧化室壓力：30 Psig；毛細管電壓3.5 kV；TOF檢測電壓120 V；捕捉電壓65 V；每1 s采集一次圖譜；全掃描(MS scan)，質量掃描范圍：m/z 100～1000；實驗數據采用Agilent MassHutter Qualitative Analysis B.04.00質譜工作站軟件處理。

2.3 供試品溶液的制備

取14份不同的枳實藥材適量，采用CW130粉碎機粉碎，在溫度為60 ℃下烘干。分別稱取枳實藥材粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，用KQ-500VDB型超聲波清洗器設置超聲提取時間為30 min，放冷，過濾，濾液置50 mL容量瓶中，濾渣重復提取1次，合并濾液，定容。提取液于高速離心機下16000 r·min-1離心10 min，取上清，進樣。

2.4 對照品溶液的制備

分別精密稱量新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷對照品適量，用適量甲醇溶解配成濃度約1 mg·mL-1的儲備液，分別稀釋至所需的混合對照品儲備液。-20 ℃保存，備用。待進液相和質譜。

2.5 測定方法

精密量取上述混合供試品溶液和對照品溶液，進樣量10 μL，分析時間為75 min，注入高效液相色譜儀和Agilent 1260高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器及Agilent 6224 TOF-LC-MS系統，記錄時間為75 min色譜圖，色譜圖見圖1和圖2，質譜圖見圖5和圖6。

圖1 枳實藥材供試品的高效液相色譜圖

圖2 對照品指紋圖譜

2.6 方法學考察[2]

2.6.1 精密度實驗

分別吸取同一(本實驗選擇的編號為S1枳實樣品)供試品溶液，連續進樣6次，每次進樣10 μL，記錄高效液相色譜圖。計算相對保留時間和相對峰面積的RSD，結果表明：所有共有峰的相對保留時間的RSD值小于0.32%，相對峰面積的RSD值小于1.25%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩定性實驗

取同一(本實驗選擇的編號為S1枳實樣品)供試品溶液10 μL，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣6次。計算相對保留時間和相對峰面積的RSD，結果表明：所有共有峰的相對保留時間RSD值小于0.12%，相對峰面積的RSD值小于1.53%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.6.3 重現性實驗

取同一批枳實(本實驗選擇的編號為S1枳實樣品)6份，按照枳實供試品溶液的制備方法平行制備供試品溶液，記錄高效液相色譜圖。計算相對保留時間和相對峰面積的RSD，結果表明：所有共有峰的相對保留時間的RSD值小于0.25%，相對峰面積的RSD值小于2.18%，表明方法重現性良好。

2.7 枳實藥材指紋圖譜的建立、測定及分析[19]

2.7.1 指紋圖譜分析軟件的應用

按照上述確定的色譜-質譜條件和供試品溶液的制備方法，測定了14批不同產地和不同炮制方法的枳實的色譜質譜聯用技術的指紋圖譜。因圖譜中各個物質分離度良好，含量較高，所以選其作為枳實藥材質量和活性的指標。采用國家藥典委編的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004 A版》。參數設置如下：采用序號S1枳實樣品作為相似度計算時校正的參照圖譜；選取0.10 min為“時間窗寬度”；選用多點校正的“校正方式”。

圖3 14批枳實藥材的高效液相指紋重疊圖譜(S1～S14代表樣品組別從1到14)

高效液相色譜指紋圖譜的生成：選擇編號從S1到S14的共14批枳實藥材色譜圖生成高效液相色譜重疊圖譜見圖3，軟件生成的對照高效液相色譜-質譜指紋圖譜見圖4，通過軟件就算的相似度計算結果見表3。

圖4 軟件生成的枳實藥材對照指紋圖譜

圖5 放大的枳實藥材總離子流圖譜

圖6 枳實(樣品1)總提取物的正離子模式(a)和負離子模式總離子流圖(b)

2.7.2 共有峰的確定

精密量取14批枳實供試品溶液，記錄枳實藥材總離子流色譜圖，通過比對相同保留時間的紫外光譜圖，最終選擇了10個特征峰作為指紋圖譜的共有峰，見圖5。經HPLC-ESI/DAD-TOF-MS檢測得到枳實中各化學成分的保留時間和質譜信息，并結合提取離子流圖(“ESI(+)/DAD-TOF-MS和ESI(-)/DAD-TOF-MS”的質譜總離子流圖(TIC)，見圖(6)及與對照品、相關文獻數據[20-31]對比，從而對枳實進行化學成分確認，樣品中分析鑒定的成分見表2。

枳實藥材的總離子流色譜圖中，保留時間為39.886 min，43.696 min處出現2個色譜峰，它們具有相同的相對分子質量，但具有不同的保留行為，其提取離子色譜圖見圖6。其中，通過與對照品比對，確定保留時間為39.886 min的色譜峰為新橙皮苷，43.696 min的色譜峰為橙皮苷。

其中tR為34.833 min的峰在ESI+，ESI-模式下分別得到m/z為581，579的離子峰，其保留時間及質譜行為與柚皮苷對照品相一致，據此確定該化合物為柚皮苷。tR為39.886 min的峰在ESI+，ESI-模式下分別得到m/z為611，609的離子峰，其保留時間及質譜行為與新橙皮苷對照品相一致，據此確定該化合物為新橙皮苷。tR為43.696 min的峰在ESI+，ESI-模式下分別得到m/z為611，609的離子峰，其保留時間及質譜行為與橙皮苷對照品相一致，據此確定該化合物為橙皮苷。

tR為28.886 min，相對分子質量596.1736，采用Mass Hunter B.04軟件處理得到分子式為C27H32O15，可知是圣草次苷或新北美圣草苷。

tR為29.781 min，相對分子質量535.1624，采用Mass Hunter B.04軟件處理得到分子式為C22H31O15，可知是苦橙甙(aurantiamar)。

同時根據已報道的文獻，將各物質出峰的先后順序、ESI+，ESI-模式下分別得到m/z等與文獻中的信息相比對，以及采用軟件處理得到的誤差，可以推測tR為26.014 min的色譜峰m/z理論值為178.0266，m/z實測值為178.031，采用Mass Hunter B.04軟件處理得到分子式為C9H6O4，可判斷為6,7-二羥基香豆素；tR為46.280 min的色譜峰的色譜峰m/z理論值為578.1636，m/z實測值為578.1636，采用Mass Hunter B.04軟件處理得到分子式為C27H30O14，可判斷為野漆樹苷；tR為48.665 min的色譜峰m/z 理論值為302.079，m/z實測值為302.0776，采用Mass Hunter B.04軟件處理得到分子式為C16H14O6，可判斷為橙皮素；tR為52.277 min的色譜峰m/z 理論值為342.1103，m/z實測值為342.1099，采用Mass Hunter B.04軟件處理得到分子式為C19H18O6，可判斷為3',4',7,8-四甲氧基黃酮；tR為54.696 min的色譜峰m/z理論值為388.1158，m/z實測值為388.113，采用Mass Hunter B.04軟件處理得到分子式為C20H20O8，可判斷為單羥基五甲氧基黃酮。

最終選擇確定這10個峰作為指紋圖譜的共有峰，其中峰1為6,7-二羥基香豆素，峰2為圣草次苷或新北美圣草苷(二者為同分異構體)，峰3為苦橙苷， 峰4為柚皮苷，峰5為橙皮苷，峰6為新橙皮苷，峰7為野漆樹苷，峰8為橙皮素，峰9為3',4',7,8-四甲氧基黃酮，峰10為單羥基五甲氧基黃酮。

表2 枳實提取物的HPLC-ESI/DAD-TOF-MS數據及成分鑒定

2.7.3 特征指紋峰的分析

表3 14批樣品相似度評價結果

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度計算軟件2004 A版》對14批枳實的指紋圖譜進行分析，14批枳實之間的相似度和生成的對照指紋圖譜的相似度如表3所示。從表3可以看出，14批枳實的相似度在0.560～0.958之間，14 批枳實藥材與生成的對照指紋圖譜的相似度在0.572～0.965之間，不同來源、不同批次的枳實藥材的特征峰峰高有明顯的差異，且相似度也有顯著的差異。

3 結 論

本實驗首次采用HPLC-DAD/ESI-TOF-MS技術對枳實中的生物堿類和黃酮類成分進行快速分析，根據高分辨質譜獲得的母離子信息，結合對照品以及參考文獻[20-31]，對枳實中多種化學成分進行了鑒定，為該藥材的GAP提供參考。

本實驗對枳實藥材高效液相指紋圖譜的構建進行了探討，可為枳實藥材的品質評價、質量標準的制定提供科學的依據。在其他條件相同的情況下，不同批次枳實藥材提取所得的14批枳實藥材醇提液的特征峰高及相似度差異較大。因此，采用高效液相指紋圖譜技術對枳實的質量控制是極有必要的，可以采用指定廠家，到符合GAP生產管理規范的基地購買道地枳實藥材。本方法學建立了枳實藥材HPLC-ESI/DAD-TOF-MS聯用色譜技術的高效液相色譜指紋圖譜，能更好更全面地控制枳實藥材的質量。10 峰分別體現了枳實藥材的特征，不僅為枳實藥材的物質基礎研究提供了部分依據，也為其整體上進行質量控制奠定了夯實的基礎，充分體現了中醫臨床用藥的特色，為延續挖掘傳統中藥復方的特色提供了有利手段。