轉錄因子21與KiSS- 1轉移抑制基因在結直腸癌中的表達及相關性分析

陳昌江，楊春康，吳賢毅，莊詠，官申，簡錦亮

福建省腫瘤醫院/福建醫科大學附屬腫瘤醫院胃腸腫瘤外科，福州350014

結直腸癌已成為中國發病率上升最快的惡性腫瘤之一[1]，嚴重威脅著國人的生命與健康。腫瘤的復發和轉移是當前影響治療效果的主要難題，更是影響患者預后的關鍵因素。KiSS-1轉移抑制基因（KiSS-1 metastasis suppressor，KISS1）作為腫瘤轉移抑制基因，已被研究證實其表達下調與結直腸癌等多種腫瘤的遠處轉移密切相關[2]。轉錄因子 21（transcription factor 21，TCF21）屬于堿性螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix proteins，BHLH）家族成員，是一類具有轉錄調節作用的效應因子，能介導間質細胞向上皮細胞的轉化，其表達下調可能促進腫瘤細胞的擴散[3-6]。本研究旨在通過檢測TCF21與KISS1在結直腸癌組織中的表達情況，分析二者是否存在相關性及其臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年7月至2018年10月福建省腫瘤醫院收治的結直腸癌患者的病歷資料。所有患者均有明確的病理學診斷，術前均未行放化療等輔助治療，臨床及病理資料完整。共納入71例結直腸癌患者，其中男47例，女24例；年齡27～80歲，平均（61.51±11.33）歲；臨床分期：I+Ⅱ期37例，Ⅲ+Ⅳ期34例；有淋巴轉移31例，無淋巴轉移40例；有遠處器官轉移12例，無遠處器官轉移59例。收集結直腸癌根治術后原發腫瘤組織及相應癌旁正常組織各71例。

1.2 試劑

濃縮型鼠抗KISS1單克隆抗體（sc101246）購自美國Santa Cruz公司；濃縮型兔抗人TCF21蛋白多克隆抗體（ab32981）購自英國Abcam生物公司；二抗試劑盒PV9001及二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）-kit試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學通用二步法

將組織2.5 μm連續切片后60℃恒溫箱烘烤過夜，以使切片緊密黏附；順序經二甲苯，梯度酒精脫蠟、水化；TCF21和KISS1均采用檸檬酸緩沖液高壓熱力修復；加3% H2O2溶液孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶；滴加一抗，TCF21孵育1 h，KISS1孵育2 h；依序滴加PV9001工作液試劑1、2，各自孵育20 min；滴加新鮮配制的DAB顯色試劑顯色，顯微鏡下控制顯色，時間3～10 min；蘇木素復染，自來水返藍，脫水透明后中性樹膠封片，室溫20～30℃。

1.4 染色結果判定

KISS1以已知陽性切片為陽性對照，TCF21以正常肺泡上皮細胞切片為陽性對照。陰性對照采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗，其他步驟不變。采用雙盲閱片，隨機觀察5個高倍鏡視野（×400）范圍，結果采用半定量方法判斷。染色程度評分：無顯色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞所占比例評分：＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。兩項評分相乘，0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。陽性表達率=（弱陽性+中等陽性+強陽性）例數/總例數×100%。

1.5 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，相關性分析采用Spearman等級法檢驗；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCF21、KISS 1表達情況的比較

TCF21表達于腫瘤細胞核或細胞質中，以細胞質表達明顯；結直腸癌組織中TCF21的陽性表達率為66.20%（47/71），明顯低于癌旁正常組織的91.55%（65/71），差異有統計學意義（χ2=21.434，P＜0.01）。KISS1表達于腫瘤細胞質中；結直腸癌組織中KISS1的陽性表達率為70.42%（50/71），明顯低于癌旁正常組織的94.37%（67/71），差異有統計學意義（χ2=14.030，P＜0.01）。（圖1）

圖1 TCF21、KISS 1在結直腸癌組織中的表達情況（免疫組織化學染色，×200）

2.2 不同臨床特征的結直腸癌患者的結直腸癌組織中TCF21、KISS 1表達情況的比較

不同性別、年齡、分化程度、病理類型、浸潤深度、瘤體大小以及有無脈管癌栓、壞死、神經浸潤的結直腸癌患者的結直腸癌組織中TCF21與KISS1陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。有淋巴結轉移、有遠處轉移及臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期的結直腸癌患者的結直腸癌組織中TCF21陽性表達率分別低于無淋巴結轉移、無遠處轉移及臨床分期為I+Ⅱ期的患者，差異均有統計學意義（χ2=5.230、8.849、7.649，P＜0.05）；有淋巴結轉移、有遠處轉移及臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期的結直腸癌患者的結直腸癌組織中KISS1陽性表達率分別低于無淋巴結轉移、無遠處轉移及臨床分期為I+Ⅱ期的患者，差異均有統計學意義（χ2=4.034、7.515、6.622，P＜0.05）。（表1）

2.3 TCF21與KISS 1表達情況的相關性

TCF21與KISS1在結直腸癌、癌旁正常組織中的陽性表達率均呈正相關（r=0.450、0.365，P＜0.05）。

3 討論

TCF21參與了腎、肺等器官的形態發生過程，介導間充質-上皮轉化（mesenchymal-epithelialtransformation，MET）過 程 。 Richards等[7]認 為TCF21基因的表達缺失可能是腫瘤細胞獲得侵襲特性的一種原因，并在多種惡性腫瘤中處于甲基化沉默狀態或表達缺失。TCF21基因的沉默表達可能導致正常的MET過程被逆轉，即出現上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT），這也正是多種惡性腫瘤侵襲與轉移的重要機制[8]。本研究發現在結直腸癌組織中TCF21同樣存在低表達或表達缺失，且與結直腸癌的轉移特性密切相關，這是否與發生了EMT過程相關，有待更多的研究證實。

表1 不同臨床特征的結直腸癌患者的結直腸癌組織中TCF21、KISS 1表達情況的比較（n=71）

目前對結直腸癌中引起KISS1基因表達下調的具體調控機制研究仍較少，日本學者在惡性黑色素瘤的研究中發現，KISS1基因表達缺失與染色體6q16.3-q23區域的雜合性缺失密切相關，而TCF21基因恰位于人染色體6q23-24[9]。Khelifa等[10]同樣在黑色素瘤的研究中發現TCF21通過與另外的BHLH蛋白（E12和TCF12）結合而作用于KISS1基因的上游啟動子，從而增強KISS1基因的表達水平；相反，TCF21的表達沉默將會引起KISS1基因上游啟動子無法被有效激活而出現KISS1基因的表達下調甚至沉默，同時引起腫瘤細胞的侵襲與遷移活性增強。國內學者張輝等[11]發現TCF21和KISS1基因與腎癌的侵襲轉移相關，TCF21在腎癌細胞中能夠正性調節KISS1的表達。本研究發現結直腸癌中TCF21與KISS1的表達與臨床分期、淋巴結轉移及遠處轉移均密切相關，且二者呈正相關。故推測在結直腸癌的惡性演進過程中TCF21可能同樣正性調控KISS1的表達而達到腫瘤轉移抑制作用。

綜上所述，TCF21與KISS1的表達與結直腸癌的病理特征密切相關，其聯合檢測，對預測結直腸癌復發和轉移風險可能具有一定的價值。TCF21基因有可能通過調節KISS1基因表達或其他機制影響結直腸癌的復發與轉移過程。