細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17 A在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況及臨床意義△

吳烜，童剛領(lǐng)，程勃然，余少康，靳楓，王樹濱#

1北京大學(xué)深圳醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東深圳518036

2深圳市胃腸腫瘤轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518036

3深圳北京大學(xué)香港科技大學(xué)腫瘤研究所，廣東深圳518036

鼻咽癌是中國華南地區(qū)高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，世界上多數(shù)國家的鼻咽癌發(fā)病率為（0.5～1）/10萬，而廣東、廣西、湖南、福建、江西等南方地區(qū)鼻咽癌的發(fā)病率高達(dá)20/10萬人，發(fā)病人數(shù)約占全國總發(fā)病人數(shù)的80%[1-2]。以放化療為主的鼻咽癌治療方法已進(jìn)入平臺(tái)期，針對(duì)鼻咽癌發(fā)病機(jī)制的新型系統(tǒng)性靶向治療受到越來越多的關(guān)注，但目前未有能夠帶來確切生存獲益的靶向藥物。病因?qū)W研究顯示，鼻咽癌的發(fā)病與EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染密切相關(guān)[3]。循環(huán)中的EBV DNA來源于腫瘤細(xì)胞，且能夠反映腫瘤負(fù)荷，與腫瘤的臨床分期、預(yù)后及療效緊密相關(guān)[4]。本課題組前期研究證明鼻咽癌中EBV感染可致γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）等細(xì)胞因子的表達(dá)水平升高，而IFN-γ又可上調(diào)腫瘤細(xì)胞中程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）的表達(dá)，從而引起免疫逃逸，影響患者預(yù)后[5]。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17A是一種由輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子。研究顯示，在乳腺癌、卵巢癌、大腸癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中，IL-17A具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生及發(fā)展的作用[6-7]。另有研究顯示，IL-17A在EBV陽性胃癌中呈高表達(dá)，EBV可增強(qiáng)IL-17A的表達(dá)[8]?；诖?，本研究通過免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)鼻咽癌組織及癌旁組織中IL-17A的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，并分析鼻咽癌組織中IL-17A表達(dá)情況與患者臨床特征、預(yù)后及PD-L1表達(dá)的關(guān)系，旨在探討其在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2013年10月至2018年10月于北京大學(xué)深圳醫(yī)院、中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院、中山大學(xué)第五醫(yī)院確診的90例鼻咽癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為鼻咽癌；②術(shù)前未行激素治療、化療、放療等；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤；②存在精神疾病或凝血功能障礙；③年齡＜18歲；④正在參與其他研究。90例患者中，男67例，女23例；年齡34～73歲，平均年齡（55.09±8.46）歲；分化程度：高分化28例，中分化45例，低分化17例；臨床分期：I期8例，Ⅱ期24例，Ⅲ期39例，Ⅳ期19例。收集患者的鼻咽癌組織標(biāo)本90例和癌旁組織標(biāo)本90例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，所有患者均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法

采用甲醛溶液固定組織標(biāo)本，石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度為4 μm），常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，常規(guī)脫蠟，微波抗原修復(fù)，滴加10%山羊血清（封閉組織內(nèi)非特異性抗原），并加入適量的兔抗人IL-17A和PD-L1抗體，4℃冰箱內(nèi)孵育24 h，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）替代一抗作為陰性對(duì)照。于次日滴加適量的生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察，以試劑盒提供的陽性標(biāo)本作為陽性對(duì)照。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法結(jié)果判讀

IL-17A、PD-L1蛋白陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色或棕褐色顆粒。于400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察視野內(nèi)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和總細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過半定量積分法進(jìn)行判定。依據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。依據(jù)陽性細(xì)胞比例評(píng)分：陽性細(xì)胞比例≤5%為0分，5%＜陽性細(xì)胞比例≤25%為1分，25%＜陽性細(xì)胞比例≤50%為2分，50%＜陽性細(xì)胞比例≤75%為3分，陽性細(xì)胞比例＞75%為4分。將上述兩項(xiàng)評(píng)分相乘，0分代表陰性（-），1～4分代表弱陽性（+），5～8分代表中等陽性（++），9～12分代表強(qiáng)陽性（+++）。

1.4 觀察指標(biāo)

收集患者的一般資料，主要包括年齡、性別、臨床分期、組織分化程度、T分期、N分期、EBV狀態(tài)。比較鼻咽癌組織及癌旁組織中IL-17A的陽性表達(dá)率，分析不同臨床特征鼻咽癌患者鼻咽癌組織中IL-17A的表達(dá)情況，以及鼻咽癌組織中IL-17A與PD-L1表達(dá)的相關(guān)性。分析IL-17A陽性和陰性患者的總生存情況和無進(jìn)展生存情況。

1.5 隨訪方法

采用電話及門診方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2020年4月，記錄患者的預(yù)后情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，-組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Logrank檢驗(yàn)；采用Spearman相關(guān)分析法進(jìn)行相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌組織和癌旁組織中IL-17 A陽性表達(dá)率的比較

IL-17A蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，陽性顆粒為棕褐色或者棕黃色（圖1）。鼻咽癌組織中IL-17A的陽性表達(dá)率為62.22%（56/90），高于癌旁組織的12.22%（11/90），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=48.144，P＜0.05）。

2.2 不同臨床特征鼻咽癌患者鼻咽癌組織中IL-17 A表達(dá)情況的比較

不同年齡、性別鼻咽癌患者鼻咽癌組織中IL-17A的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同臨床分期、組織分化程度、T分期、N分期、EBV陽性情況鼻咽癌患者鼻咽癌組織中IL-17A的陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征鼻咽癌患者鼻咽癌組織中IL-17 A表達(dá)情況的比較（n=90）

2.3 鼻咽癌組織中IL-17 A與PD-L 1表達(dá)的相關(guān)性

90例鼻咽癌組織中，PD-L1陽性52例，陰性48例。PD-L1陽性患者的IL-17A陽性表達(dá)率為90.38%（47/52），明顯高于 PD-L1陰性患者的18.75%（9/48），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=51.982，P＜0.01）。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中PD-L1與IL-17A的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.576，P＜0.05）。（表2）

表2 鼻咽癌患者鼻咽癌組織中IL-17 A和PD-L 1的表達(dá)情況

2.4 生存情況的比較

隨訪時(shí)間為3～78個(gè)月，90例患者均未失訪。IL-17A陽性患者的中位生存期為28.5個(gè)月，短于IL-17A陰性患者的44.7個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.311，P＜0.05）。IL-17A陽性患者的中位無進(jìn)展生存期為22.9個(gè)月，短于IL-17A陰性患者的39.8個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.239，P＜0.05）。（圖2、圖3）

圖2 IL-17 A陽性（n=56）與IL-17 A陰性（n=44）患者的總生存曲線

圖3 IL-17 A陽性（n=56）與IL-17 A陰性（n=44）患者的無進(jìn)展生存曲線

3 討論

在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞受到天然免疫和獲得性免疫的免疫監(jiān)視。該區(qū)域存在豐富的炎性細(xì)胞因子，協(xié)調(diào)抗腫瘤免疫平衡。然而，腫瘤細(xì)胞也“劫持”了炎癥通路（適應(yīng)性信號(hào)通路），通過增強(qiáng)PD-L1的表達(dá)抑制抗腫瘤免疫，并為腫瘤的發(fā)展創(chuàng)造有利條件[9]。例如，為了避免T細(xì)胞攻擊，腫瘤細(xì)胞采用干擾素（interferon，IFN）-g/JAK激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transduction and activator of transcription 1，STAT1）途徑增加PD-L1mRNA 的表達(dá)[10]。IFN-γ是由T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生的一種促炎細(xì)胞因子，能夠增強(qiáng)主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞呈遞新抗原。腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的PD-L1通過IFN-g/JAK/STAT1途徑滅活細(xì)胞毒性T細(xì)胞，減弱腫瘤微環(huán)境中的免疫監(jiān)視。有研究報(bào)道，其他炎性細(xì)胞因子也可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞或腫瘤相關(guān)間質(zhì)細(xì)胞中PD-L1mRNA的表達(dá)，如Toll樣受體3（Tolllike receptor 3，TLR3）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、IFN-α/β、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和 IL-4/6/17/27 以及趨化因子CXCL9/10/11、CCL20等[11]。

IL-17是一種由Th17細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，其他類型的細(xì)胞也產(chǎn)生這種細(xì)胞因子，包括第3組固有淋巴樣細(xì)胞（innate lymphoid cell 3，ILC3）、γδT細(xì)胞、不變的自然殺傷T細(xì)胞、淋巴組織誘導(dǎo)因子樣細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等[12]。研究表明，IL-17A在多種腫瘤中表達(dá)升高，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。而EBV陽性腫瘤的主要特征是明顯的炎性浸潤，主要由CD8+或CD4+T細(xì)胞組成。腫瘤組織中的EBV狀態(tài)與炎性因子的水平密切相關(guān)。van Beek等[13]檢測了28例EBV陽性腫瘤患者和34例EBV陰性腫瘤患者血漿中92種免疫相關(guān)蛋白的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8種炎性因子的表達(dá)水平與EBV陽性有關(guān)，其中包括IL-17A。本研究結(jié)果顯示，IL-17A主要表達(dá)于鼻咽癌組織的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，且在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織；IL-17A表達(dá)水平也與EBV感染有關(guān)，提示其在EBV陽性的腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。

IL-17可通過促進(jìn)腫瘤發(fā)生、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后較差。IL-17可以上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGFC）和血管內(nèi)皮生長因子D（vascular endothelial growth factor D，VEGFD）的表達(dá)，誘導(dǎo)淋巴管生成和血管生成，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[14]。另有研究表明，IL-17可激活Src促進(jìn)癌變[15]。其中一個(gè)主要的Src激活途徑是磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號(hào)通路，它誘導(dǎo)核因子κB抑制劑（inhibitor of nuclear factor-κB，I-κB）磷酸化，激活致癌蛋白鼠雙微體 2（mouse double minute 2，MDM2），阻斷p53信號(hào)通路。而激活的PI3K/AKT信號(hào)通路也阻斷了抑制細(xì)胞凋亡通路的Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白[16]。此外，IL-17還可誘導(dǎo)促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）活化，MAPK家族主要由p38MAPK、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和Jun激酶（Jun kinase，JNK）三個(gè)級(jí)聯(lián)信號(hào)通路組成，JNK在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[17-18]。本研究結(jié)果顯示，不同臨床分期、組織分化程度、T分期、N分期、EBV陽性情況鼻咽癌患者鼻咽癌組織中IL-17A的陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。生存分析結(jié)果顯示，IL-17A陽性患者的中位生存期和中位無進(jìn)展生存期均短于IL-17A陰性患者（P＜0.05）。提示IL-17A在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中具有一定的促進(jìn)作用。

既往研究顯示，IL-1與腫瘤免疫抑制相關(guān)，可通過誘導(dǎo)骨髓來源的抑制性細(xì)胞，刺激促炎細(xì)胞因子如 IL-6、TNF-β和IFN-γ的表達(dá)，與之共同發(fā)揮作用，從而抑制機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)，導(dǎo)致腫瘤生長[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞中PDL1及其相關(guān)因子IL-6、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）的表達(dá)，是卵巢癌預(yù)后不良的潛在生物標(biāo)志物[20]。本研究結(jié)果顯示，PD-L1陽性患者的IL-17A陽性表達(dá)率明顯高于PD-L1陰性患者（P＜0.01），且鼻咽癌組織中PD-L1與IL-17A的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。上述結(jié)果表明IL-17A可能參與鼻咽癌的免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。然而其具體的作用機(jī)制仍需要通過建立鼻咽癌動(dòng)物模型進(jìn)行深入研究。

綜上所述，IL-17A在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率較高，其表達(dá)情況與EBV感染、PD-L1表達(dá)情況、臨床分期、組織分化程度及預(yù)后有關(guān)，IL-17A可能通過影響宿主免疫或腫瘤微環(huán)境參與鼻咽癌的免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。IL-17可作為預(yù)測鼻咽癌患者預(yù)后和PD-L1表達(dá)情況的潛在生物標(biāo)志物，并可能成為治療的新靶點(diǎn)。