斑馬魚神經系統相關疾病模型的應用與藥物篩選

蔡靖 李潔 蔣韻純 卞薇潔 仲兆民

摘 要：斑馬魚作為一種良好的脊椎動物模式生物，因其與人類基因相似度高、飼養成本低、繁殖速度快、胚胎透明、個體較小、實驗操作容易等特點，被廣泛應用于遺傳學和發育生物學的研究。隨著研究的深入，斑馬魚已拓展到疾病模型和藥物篩選等領域。研究表明，通過斑馬魚藥物篩選獲得的活性化合物大多在哺乳動物模型中有相似的效果，預示著斑馬魚模型在藥物篩選中充滿潛力。本文主要介紹斑馬魚模型在藥物篩選中的優勢，以及近年來斑馬魚模型在注意缺陷多動障礙、癲癇、阿爾茲海默癥和帕金森病等神經性疾病的實驗室模型建立與藥物篩選的進展，旨在幫助人們了解斑馬魚在神經性疾病新藥研發中的應用。

關鍵詞：斑馬魚;疾病模型;藥物篩選;注意缺陷多動障礙;癲癇;阿爾茲海默癥;帕金森病

中圖分類號：Q95 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2020）08-0210-04

1 斑馬魚模型在藥物篩選中的優勢

藥物研發周期往往漫長，如何在各研發階段提高藥物研發效率是迫切需要解決的問題。在臨床前研究階段，早先的研究人員主要通過各種細胞系進行高通量藥物篩選。然而，細胞水平的篩選也存在一定的缺陷：細胞系是體外水平的篩選，并不能完全反映動物復雜的整體水平的狀態;人類或動物體內不同細胞、不同組織、不同信號通路之間錯綜復雜，難以通過簡單的細胞系模擬。因此，應用動物疾病模型進行藥物篩選成為近年來的趨勢。過往經驗顯示，非人靈長類動物和嚙齒類動物模型雖然在解剖、生理和行為上與人類更加相似，但飼養成本高、難度大、實驗周期長，在藥物篩選研究中的優勢不明顯。與嚙齒動物相比，在斑馬魚模型中進行研究所需的成本和時間更少，因此斑馬魚在藥物篩選中脫穎而出，成為經濟高效的藥物篩選新寵。

斑馬魚的特點主要體現在以下幾個方面：（1）成年魚個體小，易于飼養：成年斑馬魚個體長約3～4cm，在有限的空間可以養殖相當大的群體，因此可開展大樣本研究;（2）斑馬魚發育快速、性成熟期短、繁殖力強：其性成熟期一般為3個月左右，一尾雌魚一般每次可產卵100～300枚，每周可產卵一次;（3）胚胎體外發育：斑馬魚體外受精，胚胎在母體外發育并且透明，受精卵的直徑約1mm，易于觀察和進行顯微注射、細胞移植等操作;（4）斑馬魚屬于脊椎動物，與人類的基因相似度高達85%。（5）具有較完善的胚胎和遺傳學操作技術：例如利用CRISPR-Cas9系統構建遺傳突變體、轉基因品系、斑馬魚的細胞標記、細胞譜系跟蹤、胚胎的細胞移植技術與低等模式生物類似，已經比較成熟;也可像在爪蟾上一樣做胚胎的細胞移植[1]。綜上所述，斑馬魚以其個體小、子代數量多、體外受精、胚胎透明等生物學特性可以適應高通量、實時和長時行為追蹤及分析技術的應用，有助于研究人員進行全面地檢測并評估藥物的作用效果。同時，針對上文提到的藥物在細胞水平的篩選具有的缺陷，作為一種整體動物模型的斑馬魚優勢突出。此外，斑馬魚的基因組已經被完全測序，這有利于研究人員明確基因水平上的致病原理和藥物作用機制，進一步提高藥物篩選效率。

隨著近期迅速發展的TALEN、CRISPR-Cas9等技術在斑馬魚中成功應用，對斑馬魚進行基因敲除、敲入等基因修飾的實驗得到普及。在基因功能研究方面，轉基因技術、基因過量表達技術、利用反義寡核苷酸抑制基因表達的技術、隨機或定向誘變靶基因的技術、體細胞克隆技術等[2]蓬勃發展。尤為重要的是，在中高通量藥物篩選中斑馬魚優勢顯著：（1）與嚙齒類動物不同，斑馬魚幼體更接近“幼年”狀態，神經系統成熟，重要器官功能正常，組織結構在受精后的最初幾天內完全發育;（2）在96孔板中篩選幼魚只需要毫克級別的化合物;（3）斑馬魚對藥物庫中通常使用的二甲基亞砜具有較好的耐受性;（4）溶解在游泳介質中的小分子化合物可通過皮膚從而快速擴散到達幼體的目標組織;（5）斑馬魚幼魚的血腦屏障尚未形成，因此對于篩選能夠影響神經系統的藥物具有重要意義。

2 以斑馬魚為模式生物研究的相關行為疾病

斑馬魚具有強大的行為能力、完善的行為測試可用性和自動化行為測試儀器軟硬件的適應能力[2]，因而成為研究神經紊亂疾病機制的高效模式生物（如圖1所示）。斑馬魚幼體和成體在神經科學中的應用已經有了很大發展，因為它們與包括人類在內的其他脊椎動物具有高度的遺傳和生理相似性，基因操作相對容易，中樞神經系統功能也有同源性，因此斑馬魚作為模式生物在研究人類行為相關疾病時優勢明顯。

2.1 注意力缺陷多動癥（ADHD）

注意缺陷多動障礙是一種常見的去膽汁性神經發育障礙，影響全世界3%～7%的兒童，患者的癥狀大多數會持續到成年[3]。臨床表現為與年齡和發育水平不相稱的注意力不集中和注意時間短暫，活動過度與沖動，常伴有學習困難、品行障礙和適應不良的現象。但目前用于治療ADHD的藥物僅限于緩解癥狀，并不能徹底治療或者及時預防。在已開發的幾種ADHD嚙齒動物模型，如大鼠、小鼠，并不能符合所有的有效性標準，如多動癥相關行為。因此，開發、創新和驗證替代補充模型以進一步探索多動癥相關機制、研發篩選有關藥物至關重要。

在斑馬魚的各種行為測試可以用來評估與研究多動癥。例如，可以通過將斑馬魚幼魚放在96孔板中，放入行為儀進行行為軌跡監測，以測量游泳發作頻率（Hz）和持續時間（mm）、游泳速度（mm/s）、活躍游泳時間和總距離（cm）為標準，進行較長時間的記錄來對斑馬魚幼體活動量進行評估。在五項選擇系列反應時任務（5-CSRTT，5-choice serial reaction time task）中，研究人員通過測量成年斑馬魚對五種感知相同的刺激（呈現在五個不同的空間位置）的反應能力來評估其沖動程度和注意力。研究數據顯示了這種實驗模型在評估斑馬魚注意力缺陷多動癥相關癥狀方面十分有效。

新型水箱測試也可以預測成年斑馬魚的多動癥。新型水箱測試是最常用的評估運動和焦慮樣表型的測試。該測試將單個斑馬魚放在一個新的環境中，它們通常在底部游泳，之后逐漸增加在水箱上部的活動。而評估總行程（m）、平均速度（m/s）、絕對轉角和不動度（s）這些參數的變化均可用于多動癥的表述。在斑馬魚中，性別差異會造成不同的行為，活動水平也會受到影響，這是研究多動癥的一個重要因素。測試結果顯示，與低活動度亞組的雌斑馬魚相比，高活動度亞組的雌斑馬魚更喜歡水箱的頂部，而雄斑馬魚則沒有這種偏好[4]。

斑馬魚正迅速成為多動癥研究的一種重要新型模式生物。已有多項斑馬魚行為測試顯示了與這種疾病相似的行為表現，可以用來研究其背后的遺傳與神經化學機制。最后，將基于行為的現象分析與藥物篩選技術相結合，斑馬魚將成為發現治療注意力缺陷多動癥新藥的重要動物模型。

2.2 癲癇（Epilepsy）

癲癇的主要特征是出現自發性反復發作（SRS，spontan-eous recurrent seizures）和高患病率的共病，如認知障礙、抑郁和焦慮，會嚴重影響個人生活。現有的20多種抗癲癇藥物只能提供對癥治療，且可能出現認知改變、記憶混亂的副作用。此外，有30%的病人對現有抗癲癇藥物沒有反應。因此，新的癲癇治療藥物亟待研發。嚙齒類動物模型且試驗周期長、成本大、占用空間大;無脊椎動物雖為研究癲癇提供了重要的參考，但缺乏復雜的神經系統。因此，尋找簡單、快速、特異和敏感的體內測試模型十分關鍵。

斑馬魚動物模型可以通過使用許多不同的基因編輯技術（如TALEN、CRISPR-Cas9技術），結合癲癇的獨特特征來研究這種疾病的分子結構和行為基礎。斑馬魚具有完全特化的基因組，與人類同源性較近;且具有一些傳統嚙齒動物模型所缺乏的，但有助于研究癲癇的關鍵特征：與嚙齒類動物的小鼠相比，斑馬魚的胚胎發育很快，易于細胞觀察和表型分析，可以作為研究癲癇發病機制（如早期暴露或老化）的理想選擇。此外，斑馬魚幼魚的血腦屏障尚未形成，神經系統對藥物具有很高的敏感性，配合其完善的行為測試的可用性，以及自動化行為測試儀器軟硬件的適應能力，使斑馬魚成為癲癇藥物篩選十分重要的動物模型。

基于于癲癇自發性反復發作的特性，我們可以通過Danio Vision裝置——一種帶有紅外攝像機被用作避光記錄室的儀器，來監測斑馬魚的活動狀況。在黑暗中斑馬魚度過1h，研究人員可以通過打開儀器內置的冷白色發光二極管發光至少1min，誘發斑馬魚光誘導的癲癇發作，再通過紅外線分析游程和最大加速度，并提取游程軌跡，研究癲癇的獨特特征。

目前，有關實驗開始通過三軸迷宮試驗（three-axis maze test）在藥物篩選中判斷斑馬魚模型的記憶問題。三軸迷宮是一種評估斑馬魚學習能力和自我中心記憶的方法，迷宮由一分為五的小室水槽組成，每個小室的角落或中心有一個窗口，一個漂浮的喂食環附在目標室迷宮的末端，魚需要從一個腔室游到另一個腔室，通過插入物的窗口到達目標腔室獲取食物。在三軸迷宮中，魚需要根據x（向前/向后）、y（水平）和z（垂直）軸導航。在早期研究中，已經使用各種體外和體內模型對EMB（2，5-二羥基-3-十一烷基-1，4苯醌）進行了廣泛研究，顯示出EMB有強抗驚厥、抗焦慮和抗抑郁的特性，可以改善亨廷頓氏病（HD）、多發性硬化癥（MS）、腦缺血和創傷性腦損傷（TBI）等病癥[5]。此外，在成年斑馬魚身上使用戊四氮（PTZ），給予少量促驚厥藥（PTZ）10d，使斑馬魚產生進行性慢性癲癇樣行為，再進行三軸迷宮試驗，每天檢查記憶狀態和癲癇發作的進展。結果顯示PTZ處理過的魚找不到它們去喂食環的路，反復迷路并返回到前一個隔間，而不是向前移動到喂食環。這意味著PTZ的使用損害了成年斑馬魚的記憶，之后給藥（EMB）的魚在三軸迷宮中則顯著縮短了迷宮導航時間并減少了誤差。上述結果發現EMB具有抑制癲癇樣行為，并改善因慢性癲癇而改變的認知功能的作用。

通過幾種藥理學方法誘導成年斑馬魚癲癇樣行為反應、使用各種類型的迷宮（如T軸或Y軸迷宮、光/色偏好測試和三軸迷宮）對斑馬魚進行學習和記憶功能測試，可見利用斑馬魚作為癲癇研究模型的趨勢越來越明顯。

2.3 阿爾茨海默癥（AD）

阿爾茨海默病是一種進行性神經退行性疾病，其臨床表現為記憶、認知和運動技能的障礙，以及影響運動的癥狀，如平衡、震顫、協調、失禁和進食困難等，而精神問題如抑郁、幻覺和妄想等也可能會出現。目前對人類阿爾茨海默癥的治療是基于護理，而不是預防性治療。因此進行有效預防以及篩選出能夠特異性治療阿爾茲海默癥的藥物對于該疾病的防治具有十分重要的意義。

斑馬魚的神經系統保守簡單，且擁有與人類阿爾茨海默癥相關的同源基因（包括app、mapt、pesn1和pesn2等）。于此同時，斑馬魚還有一套與人類的行為表型相當的易觀察量化的行為特征，被認為是研究神經退行性疾病的可靠脊椎動物模型。在阿爾茨海默癥斑馬魚模型中，斑馬魚不僅表現出與人類相當的認知和記憶缺陷，還表現出運動障礙。研究人員可以通過用驚嚇反應、懲罰性學習記憶模型和光介導獎勵性實驗來測試斑馬魚學習和記憶能力。對比健康斑馬魚的學習和回憶信息的能力，可檢測出斑馬魚在阿爾茨海默癥樣狀態誘發后的學習和記憶障礙，從而篩選用于治療阿爾茨海默癥的藥物。

此外，斑馬魚非常適合Ca2+成像，它們相對簡單的神經系統和胚胎的光學透明度允許實時神經成像。三維成像技術的快速發展，使整個生物體可視化，在疾病狀態下可以進行詳細的體內功能和神經生理學分析。目前，研究人員已經利用斑馬魚模型證明管花肉蓯蓉提取物可以同時治療阿爾茲海默癥和骨質疏松，斑馬魚正在成為重要的阿爾茨海默病生物模型，尤其在神經發育和神經退化方面進一步的研究空間，預示著令人興奮的研究機會。

2.4 帕金森癥（PD）

帕金森病通常表現為肌肉僵硬、靜止性震顫、運動遲緩和姿勢不穩等，患者除了具有運動性障礙，甚至可能伴隨著精神問題，如煩躁、抑郁、焦慮、睡眠障礙等非運動性癥狀[6-7]。

斑馬魚是研究運動障礙的一種良好的脊椎動物模型，研究人員通過免疫組化和原位雜交技術在斑馬魚胚胎中觀察到一些特殊的神經元，此外，又在斑馬魚中發現了與帕金森癥相關的蛋白同源物（PARKIN，DJ-1，PINK1和LRRK2），這些發現都預示著斑馬魚是一種篩選帕金森癥潛在有效藥物的優秀模式生物。

斑馬魚帕金森癥模型的行為表型通常為運動能力遲緩（運動速度和幅度的下降），焦慮、抑郁，嗅覺障礙等。而引起斑馬魚上述行為表型的原因可能是多巴胺水平降低。有研究顯示，rotenone處理后的斑馬魚是研究帕金森癥的合適模型。通過明暗箱實驗，rotenone處理后的魚較正常組，在亮室中和進入暗室前的潛伏期都會變長，表現出焦慮和抑郁;在可監測斑馬魚行為的魚缸中監測實驗組斑馬魚的運動軌跡并處理數據，發現實驗組斑馬魚的運動能力顯著降低;向魚缸中以一定速率輸送氨基酸混合物，并軟件跟蹤斑馬魚的游泳路徑，依據斑馬魚對氨基酸的特殊偏好性，發現rotenone也導致了實驗組斑馬魚的嗅覺障礙。

斑馬魚大腦中的蛋白質，如NEFL、C13-1、NAV2和GAPVD1會在帕金森病表型中下調，這表明帕金森病表型與神經通路相關。斑馬魚相對較小的尺寸、光學透明性和生命周期是同時促進多種化合物研究的有效條件，如6-羥基多巴胺（6-OHDA）斑馬魚模型的建立，以篩選神經保護和神經恢復能力的藥物。

因此，無論是從行為表型尋找、篩選潛在的帕金森癥治療藥物，還是從分子層面分析其具體機制、通路，斑馬魚都是一種良好的模式生物。

3 總結與展望

斑馬魚良好的生物學特性使其非常適合活體高通量藥物篩選，特別是在行為學基礎上對神經系統相關疾病進行藥物篩選，更有其獨特優勢，是基于靶標的藥物篩選策略模式生物的有益補充。而近年來靈活、快捷和易操作性的定點基因組修飾技術和深度、高通量新一代RNA測序技術以及單細胞測序技術的出現，使斑馬魚作為模式生物的應用更加廣泛。因此，我們能夠利用斑馬魚的優勢構建新基因型的斑馬魚，研究基因調控機制，進而利用斑馬魚模型篩選出能夠治療相關疾病的藥物。但斑馬魚動物模型進入藥物篩選領域的時間短，積累的數據不夠多，與傳統哺乳動物模型的對應關系不完備。相信在不同領域研究者的共同努力下，斑馬魚模型在藥物篩選領域的應用會更加廣泛深入，同時可以將藥物篩選與斑馬魚已有的優勢研究領域相結合，進一步加快藥物研發進程，為人類健康做出貢獻。

參考文獻

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