N-亞硝胺類基因毒性雜質的研究進展

楊 竹，杭太俊*，郭曉迪，田 蕓，曹 偉

1 中國藥科大學藥學院，南京 211198;2 普霖貝利生物醫藥研發(上海)有限公司，上海201203

1 背 景

基因毒性雜質又稱遺傳毒性雜質（Genotoxic Impurities，GTI），由于雜質的遺傳毒性主要通過沙門氏菌回復突變實驗（Ames 實驗）界定，所以也稱為致突變性雜質。基因毒性雜質一般是親電試劑（Electrophiles），它能夠與遺傳物質發生反應，直接或間接地損傷細胞DNA（包括：DNA 烷基化、染色體斷裂、DNA 重組及復制過程中共價鍵的插入和修飾等）導致基因突變并有可能誘發癌癥[1]。基因毒性雜質與其他藥物雜質相比，即使在很微量的情況下，對服藥者（尤其長期服藥者）也具有嚴重的危害性。

2018 年7 月華海藥業在纈沙坦原料藥中檢測出微量的毒性雜質N-亞硝基二甲胺（NDMA），隨后該企業主動報告給歐洲藥品管理局（EMA）以及美國食品藥品監督管理局（FDA），并觸發了歐盟審查[2]。2018 年7 月國家藥品監督管理局（NMPA）與該企業分別就纈沙坦原料藥事件進行公告說明，相關原料藥在國內外均進行了召回[3]。自此，N-亞硝胺類基因毒性雜質在藥學界受到廣泛關注。2018 年10 月，EMA 更新了纈沙坦事件的進展[4]：除該藥企外，Hetero Labs和Aurobindo Pharma 生產的部分沙坦類藥物中，也發現了N-亞硝基二乙胺（NDEA）和N-硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（NMBA）雜質，因此，EMA 將審查范圍擴展至所有沙坦類藥物[5]。2019 年9 月，FDA 發布安全警告稱，檢測出雷尼替丁藥物中含有NDMA 雜質[6]。緊接著FDA 又在降糖藥二甲雙胍中發現有微量NDMA 存在[7]。2020 年4 月，FDA 發布了召回美國市場上雷尼替丁產品的公告[8]，公告稱某些雷尼替丁產品中的NDMA 會隨著時間的推移以及在高于室溫的條件下存儲而有所增加，并可能導致消費者暴露于這種雜質的不可接受水平。同月，由于NDMA 含量超過FDA 可接受水平值，Amneal Pharmaceuticals 召回尼扎替丁口服溶液，該次召回涉及到3 個批次[9]。截至到目前，EMA 已將該類雜質的審查種類擴大至6 種[10]，即：N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（NMBA）雜質、N-亞硝基乙基異丙胺（NEIPA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）、N-亞硝基二丁胺（NDBA）。依照目前的發展趨勢來看，不排除今后會檢測出更多潛在的N-亞硝胺類基因毒性雜質。

在以上事件中所涉及的基因毒性雜質均屬于N-亞硝胺類化合物，其結構通式為R2（R1）N-N=O（見表1），當R1與R2相同時，稱為對稱性亞硝胺，如NDMA 和NDEA；當R1與R2不同時，稱為非對稱性亞硝胺，如NEIPA 等。

表1 N-亞硝胺類結構式

造成藥物中亞硝胺污染的原因主要有：（1）在藥物合成過程中發生副反應，生成具有基因毒性的N-亞硝胺類雜質，例如：仲胺、叔胺、季銨鹽類化合物與亞硝酸等亞硝化試劑相互作用[1]；溶劑N，N-二甲基甲酰胺（DMF）的氧化[11]；橡膠硫化劑與空氣中氮氧化合物相互作用[12]等。（2）藥物在儲存或者運輸過程中發生氧化或還原等反應，最終生成具有基因毒性的N-亞硝胺類雜質，例如：雷尼替丁由于結構中存在一個不穩定的二甲氨基，在儲存過程中會發生降解產生NDMA。N-亞硝胺類對人體產生基因毒性需要先經過細胞色素P450 酶催化代謝后才能和DNA 發生作用，產生基因毒性，作用機理主要有以下兩點：①代謝得到活性烷基和大分子（DNA 或者蛋白質）烷基化是產生遺傳毒性和致癌性的主要原因；②代謝得到的小分子醛會進一步和DNA 結合造成額外的損傷[13]。

2 法規的發展

全球內的主要監管機構對基因毒性雜質的監管理念大致可以概括為以下三個發展階段：最初的監管空白；追求完全避免；最后要求在風險評估的基礎上合理降低。

在2000 年以前，基因毒性雜質的研究幾乎為空白，不僅沒有任何指導原則，甚至研究理念都很模糊。隨著對基因毒性雜質的認知及檢測手段的不斷提高，在2000 年，歐洲藥品質量管理局（EDQM）發表了最早涉及遺傳毒性雜質的文章[14]，該文提醒磺酸在醇溶液中有生成磺酸酯的風險，并推測甲磺酸鹽藥品中含有烷基磺酸雜質（磺酸酯和烷基磺酸均為潛在基因毒性雜質），要求提供除《歐洲藥典》要求的限度試驗外的信息[15]，此項舉措首次對基因毒性雜質研究作了要求，開啟了藥品基因毒性雜質風險評估和控制的新紀元。但是EDQM提出的僅僅是一個理念，卻沒有限度標準和實施“指南”。于是歐洲藥品管理局（EMA）發布了遺傳毒性雜質“指南”，即《遺傳毒性雜質限度意見書》[16]，并對執行標準和實施辦法進行了公開征求意見。該意見書首次提到了閾值的設定和工藝研究的說明，但是各界對這份意見書還是存有一些疑問，主要有：標準依據可靠性、技術可行性、標準靈活性以及執行范圍等方面。鑒于各方的不滿，EMA 分別于2004 年和2006 年發布了遺傳毒性雜質限度“指南”草案和正式版本[17]，相比意見書，改進后的正式版本有了一個相對成熟的解決方案，它要求所有的基因毒性雜質都遵循毒理學每日最高允許攝入量（TTC）限度：1.5 μg·d-1。TTC 是指每人每天攝入一定量的誘變雜質，其致癌風險被認為是可以忽略的（在終生接觸的情況下，理論的致癌風險值增加十萬分之一）。可是企業在具體實施過程中發現這個標準過于籠統，于是美國藥品研究和制造專家組（PhRMA）針對該問題提出了遺傳毒性雜質的“分期TTC”和“五分類系統”的策略，并于2006 年發表在《Regulatory Toxicology and Pharmacology》雜志中[18]，該項舉措獲得了各界支持。緊隨其后，FDA 于2008 年發布了“原料藥和成品藥中遺傳毒性和致癌性雜質”行業指南草案，除服藥周期短于1 個月的具體階段化TTC 規定值有所不同之外，該草案與EMA 頒布的限度“指南”大致相同[19]。

2013 年，人用藥品注冊技術要求國際協調會議（ICH）開始對基因毒性雜質“指南”征求意見。2014 年，在EMA，PhRMA 和FDA 的基礎上，ICH 頒布了M7 指導原則[20]，原則首先肯定了EMA、FDA 的研究，并采用“分段TTC”和“五分類系統”策略，將基因毒性雜質分為五類（見表2），并做了一些調整和增補。ICH M7 是經過協調多方技術、可行性最終頒布的指南標準，所以相比EMA、FDA 以及PhRMA 的標準，限度要求有所不同。比如：對于二類、三類雜質，在同樣12 個月的服藥周期內，EMA 和FDA 都規定了每日攝入單個雜質的TTC值不得超過5μg 的限度，而ICH 的要求則放寬到20μg。當服藥周期為12 月以上時，PhRMA、EMA 和FDA 規定每日攝入單個雜質的TTC 值不得超過1.5 μg，而ICH 要求只有服藥周期10 年以上時，才需限定每日攝入單個雜質的TTC 值不得超過1.5 μg[21]。

表2 ICH M7 對基因毒性雜質的分類及控制

在ICH M7 原則中明確指出黃曲霉、N-亞硝胺類以及烷基偶氮類，由于具有高致癌活性，是特殊的基因毒性雜質，需要特別關注。N-亞硝胺類的毒理學每日最高允許攝入量是以TD50值（可通過CPDB 數據庫查詢所得）線性外推至十萬分之一計算所得。目前EMA 以及FDA 對N-亞硝胺類基因毒性雜質規定了兩年過渡期內的暫定限度（見表3），過渡期后要求N-亞硝胺類雜質不得超過0.03×10-6[22，23]。

表3 N-亞硝胺類雜質的臨時限度

相較于歐美發達國家，我國對于基因毒性雜質的監管起步較晚，但是自我國加入ICH 后，正逐漸與國際接軌。2020版《中國藥典》四部通則修訂內容（第四批）中新增了《遺傳毒性雜質控制指導原則審核稿》[24]，本次發布的審核稿中對基因毒性雜質的監管策略與ICH M7 指導原則幾乎保持一致。2020 年5 月國家藥監局藥審中心網站發布了《化學藥物中亞硝胺類雜質研究技術指導原則（試行）》[25]，該原則旨在為注冊申請上市以及已上市化學藥品中亞硝胺類雜質的研究和控制提供了指導。

3 分析方法

N-亞硝胺類化合物廣泛存在于煙熏、腌漬食品，個人護理品、化妝品以及污水中，所以在這些方面的研究較為成熟，而關于藥品中N-亞硝胺類化合物的研究則進展緩慢[26]。自2018 年“纈沙坦事件”之后，各國藥品監督管理部門開始重視N-亞硝胺類基因毒性雜質。目前FDA、EDQM 以及NMPA都發布了N-亞硝胺類基因毒性雜質的檢測方法（見表4）。由于這類雜質在藥物中一般以痕量形式存在，對分離檢測技術提出了挑戰，目前文獻中報道的常用的分離方法主要有氣相色譜法（GC）、液相色譜法（HPLC）、超臨界流體色譜法（SFC）等；檢測方法以質譜法（MS）為主，如四級桿質譜儀、飛行時間質譜儀（Q-TOF），除此之外，還有熱能分析儀（TEA）、紫外檢測器（UV）等。

表4 部分監管機構發布的檢測方法

3.1 氣相色譜法（GC）

N-亞硝胺類化合物大多揮發性較好，極性較大，根據相似相容的原理，通常選擇極性或者中等極性氣相色譜柱進行分離；GC 的進樣方式主要有頂空進樣和直接進樣。前者的前處理要求較簡單，基質污染少，但是頂空進樣對于不易揮發，高沸點的組分不太適用；直接進樣則更適合高沸點組分，但基質污染較大。當用頂空進樣分析N-亞硝胺類時，常用溶劑為NMP、DMSO 等，直接進樣常用溶劑為DCM、乙腈（ACN）、MeOH 等。

3.1.1 氣相色譜法串聯熱能分析儀 （GC-TEA） 熱能分析儀是N-亞硝胺類化合物的特異性檢測器。它的原理[29]是N-亞硝胺類化合物經氣相色譜分離之后，熱能分析儀特異性催化裂解N-亞硝胺類化合物，生成一氧化氮（NO）基團，繼而與臭氧發生反應后發出近紅外光，利用光電倍增管檢測產生的近紅外光，從而完成N-亞硝胺類化合物的測定。

早在40 年前，Castegnaro M 等[34]就報道了用GC-TEA對含氨基拉明、二硫磷和土霉素進行揮發性N-亞硝胺的檢測。結果表明，在46 種不同的藥物中，有45 種均檢測到NDMA（1～900 μg·kg-1），所有含有二硫胺素的藥物均含有濃度為94～980 μg·kg-1的NDEA。咸瑞卿等[35]建立了一種GCTEA 法用于檢測纈沙坦原料藥及其制劑中N-二甲基亞硝胺（NDMA）的含量，結果顯示，該法專屬性強，線性范圍為10～1000 ng·mL-1，檢測限為3 ng·mL-1，回收率在94%～100%，用該法對13 批沙坦類藥物進行測定，其中3 批纈沙坦原料藥、5 批含纈沙坦制劑中NDMA 含量范圍為0.41～87.09×10-6。雖然熱能分析儀均能專屬檢測N-亞硝胺類化合物，但儀器價格較為高昂，應用范圍相對較窄，因而限制了它的廣泛應用。

3.1.2 氣相色譜串聯質譜法（GC-MS） 氣相色譜串聯質譜法，是目前測定N-亞硝胺類化合物較為廣泛的分析方法，該法利用了質譜儀的準確、快速等優點同時進行定性和定量檢測。GC-MS 的電離方式主要有電子轟擊離子化（EI）和化學電離（CI）兩種電離方式，檢測器有單極質譜也有聯用質譜，一般而言，單極質譜沒有聯用質譜靈敏度高。

Tsutsumi T 等[36]報道了GC-MS 直接進樣法測定沙坦類藥物中NDMA。在該法中二氯甲烷溶解樣品后經超聲、振搖、離心，取上清液用無水硫酸鈉脫水，添加一定量的NDMA d6內標后進樣測定，結果顯示，該法具有良好的專屬性，檢測限為0.001 μg·mL-1，回收率達99%，使用該法檢測市場中多批纈沙坦制劑，發現不同廠家、不同批次之間NDMA 的含量都不盡相同，有些檢出、有些則未檢出，在該研究中發現DCM用作溶劑時，不僅毒性較大，而且基質中脂溶性高的組分也會溶解在其中，會對測定造成一定的干擾。賈磊娜等[37]采用GC-MS 測定14 種不同品牌、型號的橡皮擦，從中檢出5 種亞硝胺（NDMA、NDEA、NDPA、NDBA、NDPhA）及其前體物，作者以人工汗液為模擬遷移物，經固相萃取柱凈化后，對其進行定性定量分析，5 種N-亞硝胺在0.005～10 μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系，相關系數（r）均為0.999 0 以上，橡皮擦樣品測定結果顯示：N-亞硝胺的總檢出含量為29.09～34.1μg·kg-1，N-亞硝胺前體物的總檢出含量為25.26～51.68 μg·kg-1。Roasa J 等[38]采用頂空固相微萃取法（HS-SPME）對肉類樣品中的9 種揮發性亞硝胺進行了測定，并進行了GC-MS 分析，在該法中萃取柱是50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲硅氧烷熔融石英纖維柱，最佳萃取條件為65 ℃、36%（w/v)NaCl 萃取45 min，線性相關系數均在0.997 0 以上，回收率為97%～113%，其中7 種N-亞硝胺類靈敏度在3.6 μg·kg-1以下，作者用該方法測定了4 種肉制品中亞硝胺的含量，發現頂空固相微萃取能夠有效去除基質的污染，提高靈敏度；但固相微萃取檢測范圍較窄，檢測周期較長，且萃取纖維貴，定量檢測的精確度不高。

對于不能直接測定或者不穩定的N-亞硝胺類化合物，可以考慮采用衍生化法。Wang X 等[39]首先用氫溴酸和乙酸的混合溶液硝化亞硝胺類，然后用對甲苯磺酰氯進行磺酰化反應，最后采用氣相色譜-低分辨質譜聯用電子沖擊源法測定了8 種亞硝胺類化合物，并比較了有無衍生化測定亞硝胺類化合物，結果表明，衍生化后的色譜行為更佳，質量響應更大；但是衍生化通常反應不完全，操作復雜，定量不準確，對于藥物中痕量亞硝胺類是不適用的。

3.2 高效液相色譜法（HPLC 法）

HPLC 法是最常見的色譜分析儀器，可以配備多種不同的檢測器，廣泛應用于分析領域。由于N-亞硝胺類化合物的性質以及樣品中含量低等原因，使用紫外檢測器（UV）進行檢測的研究很少[40]，通常使用質譜儀進行檢測。

3.2.1 高效液相色譜法串聯紫外檢測器（HPLC-UV） Sayaka M 等[41]建立了一種HPLC-UV 定量檢測纈沙坦中NDMA的方法，樣品用甲醇溶解后再經離心、過濾、進樣檢測。色譜柱為Inertsil ODS-3（150×4.6 mm，5 μm，GL Science，Tokyo，Japan），以乙腈-水（均含0.1%甲酸）系統作為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為235 nm，結果表明，該方法檢測限為0.008 5 μg·mL-1。HPLC-UV 法成本低，應用范圍廣，更適合常規分析，可用于快速篩選纈沙坦藥物中的NDMA 污染。同樣，法國國家藥品和保健品安全管理局也發布了HPLC-UV法用于測定纈沙坦原料藥及其制劑中的NDMA[42]。

3.2.2 高效液相色譜串聯質譜法 （HPLC-MS） HPLC-MS法相較于GC-MS 來說，靈敏度更高，離子源種類也更多。Fritz S 等[43]建立了一種APCI 電離的HPLC-MSMS 聯用技術，用于測定沙坦類藥物中的NDMA 和NDEA 兩種雜質，在該方法中，樣品用甲醇溶解后經超聲、離心、取上清液后進樣，色譜柱為Synergi Polar-RP（50 mm×4.6 mm，2.5 μm），流動相為甲醇-水（0.1%甲酸）體系，在該文獻中利用了N-亞硝胺類在紫外下降解的性質，通過對比紫外照射前后峰面積的變化情況進行定性驗證；此外，在應用該方法測定沙坦類藥物時發現了兩種新的雜質：戊酰胺和N，N-二甲基戊酰胺。除APCI 離子源外，ESI 離子源也可以用于N-亞硝胺類化合物的測定。Herrmann SS 等[44]建立了一種用于測定肉制品中揮發性亞硝胺和非揮發性亞硝胺含量的HPLC-（APCI/ESI）MS MS 法，還比較了兩種不同電離方式對測定的影響，結果發現，當檢測標準品時，ESI 源電離后的響應更大，但檢測樣品時，APCI 源電離后的響應更大，背景干擾更小，基質誘導離子抑制效應更小，這可能是由于APCI 源的電離過程發生在氣相，待測組分分子在空間上與基質分子分離得更多，因此使用APCI 離子源的基質干擾更小，更有利于N-亞硝胺類的痕量分析。

4 小結與展望

自纈沙坦中檢出NDMA 后，N-亞硝胺類化合物的檢出范圍不斷擴大，從沙坦類藥物到雷尼替丁、二甲雙胍、尼扎替丁……下一個又會是何物呢？隨著N-亞硝胺類化合物在藥物中頻頻檢出，制藥行業以及藥品監管部門對該類基因毒性雜質的控制勢必會越來越重視，該類雜質的控制也會更加科學合理。在理論上，所有藥物都存在N-亞硝胺類雜質或被N-亞硝胺類雜質污染的風險，因此建立便捷、高效的分析方法是非常有必要的。但目前仍然存在一些挑戰：藥物基質與N-亞硝胺類化合物如何高效地分離；分離之后如何富集等等，均是有待研究的。此外，目前主流檢測儀器是質譜儀，但儀器價格高昂，并不是所有實驗室、藥檢單位都能具備的檢測條件，所以開發通用、簡便、靈敏度高的分析檢測方法迫在眉睫。