HPLC 法同時測定代代花中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的含量

承 晨，李 莉

常州市食品藥品監督檢驗中心，常州213000

代代花，又名枳殼花、酸橙花、香櫞花，為蕓香科植物代代花Citrus aurantium L.var.amara Engl.的干燥花蕾，是藥食同源之品。其成熟果呈橙紅色，留于樹上至次年夏變為污綠色，狀如回生，故其果又名回青橙、回春橙。“代代”即謂其可回生續代。5～6 月花未開放時分批采摘，及時干燥。以完整、色黃白、香氣濃者為佳。主產于江蘇、浙江等省。味甘、微苦，平，歸肝、胃經。具有理氣、寬胸、開胃的作用，主要用于胸脘脹悶、惡心嘔吐、食欲不振[1-3]。

代代花中含有豐富的揮發油和柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、構椽皮素等黃酮類及N-甲基酪胺、辛弗林等生物堿成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、促進胃腸蠕動等藥理作用[4-6]。除有文獻報道對其干花的揮發油進行過研究外，而對黃酮類、生物堿成分的研究也僅局限于其果實枳殼[7，8]。為完善代代花的含量分析，保障藥材質量，本文建立了高效液相色譜法同時測定代代花中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的含量。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Waters2695 高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器）及Waters Empower 色譜工作站（美國沃特世公司）；XP105DR 十萬分之一電子天平（美國Mettler 公司）。

1.2 藥品與試劑

5 批代代花購于市場，分別產自徐州、常州、蘇州、南通，均經江蘇省炮制規范修訂專家組（中國藥科大學余伯陽教授、中山植物園徐增萊教授、江蘇省中醫院朱育鳳主任）鑒定確認。

柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林對照品（分別為： 批號110722-201613，純度94.3%；110721-201310，純度96.1%；111857-201102，純度99.6%；110727-201608，純度99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純；冰醋酸、十二烷基硫酸鈉為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4.0 μm）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；DAD 檢測器，進樣量10 μL。流動相A 為乙腈，流動相B 為20%乙腈水溶液（含0.08%十二烷基硫酸鈉的2.4%冰醋酸），梯度洗脫（0～15 min，0%～10%A；15～20 min，10%～60%A；20～25 min，60%～0%A）。檢測波長：柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷為283 nm，辛弗林為275 nm。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、辛弗林對照品適量，置于同一100mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為1.007、0.1049、2.940、0.1003mg·mL-1的對照品貯備液。分別精密量取對照品儲備液5mL，置50mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。每1 mL 分別含柚皮苷0.1007mg、橙皮苷0.01049mg、新橙皮苷0.2940mg、辛弗林0.01003mg。冷藏，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取代代花細粉0.1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱重，加熱回流1 h，放冷，加入50%甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液即得。

2.4 系統適用性與專屬性

取混合對照品溶液、供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定，結果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

（A）混合對照品色譜圖；（B）供試品色譜圖；（C）空白溶劑色譜圖1.柚皮苷；2.橙皮苷；3.新橙皮苷；4.辛弗林

由圖1 可知，4 種成分色譜峰分離度良好（分離度>1.5），且均可通過DAD 純度檢測。方法專屬性良好。

2.5 線性與范圍

分別精密吸取“2.2”對照品貯備液1 mL 至2、5、10、20、50、100、200 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”色譜條件進樣，記錄峰面積，以峰面積值（Y）-進樣濃度（X，mg·mL-1）進行線性回歸（n=8），得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的回歸方程（相對偏差、線性范圍）分別為：Y=1.580×107X-2.771×104（r=1.000 0，5.035～1007 μg·mL-1）；Y=1.728×107X-978.1 （r=1.0000，0.5250～104.9μg·mL-1）；Y=1.852×107X-5.832×104（r=1.000 0，14.70～2940 μg·mL-1）；Y=4.025×106X-196.8 （r=0.999 8，0.502 0～100.3 μg·mL-1）。

2.6 定量限考察

將對照品儲備液用50%甲醇進行多次等倍稀釋，信噪比S/N 為10 時，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林最低定量限分別為0.5035、0.5512、0.5250、0.502 μg·mL-1。

2.7 進樣精密度試驗

精密吸取“2.2”項下的混合對照品溶液10 μL，按“2.1”色譜條件測定，重復進樣6 次，記錄峰面積。結果顯示，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的峰面積RSD 值分別為0.2%、0.2%、0.1%、0.2%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復性試驗

取1 批代代花（產地：蘇州，批號151014）6 份，按“2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液及供試品溶液10 μL，按“2.1”色譜條件測定，用外標法測定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的含量。結果顯示，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的RSD 值分別為0.5%、0.7%、0.6%、0.7%，表明方法的重復性良好。

2.9 穩定性試驗

取1 批代代花（產地：蘇州，批號151014），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0、12、24、36、48 h 按“2.1”項下色譜條件取10 μL 進樣，測定各成分的峰面積。結果顯示，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林峰面積的RSD 值分別為0.3%、0.5%、0.2%、0.5%，表明供試品溶液在48 h 內穩定。

2.10 加樣回收率試驗

取同一批已知含量的代代花（產地：蘇州，批號151014）6 份，每份精密稱取50 mg，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，精密加入柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林濃度分別為50.35、10.49、147、10.03 μg·mL-1的混合對照品溶液25 mL 及50%甲醇25 mL，按“2.1”色譜條件進樣，分別測定其峰面積，用外標法計算加樣回收率和RSD，結果見表1。

2.11 樣品測定

取5 批代代花，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液及供試品溶液10 μL，按“2.1”色譜條件測定，用外標法分別計算含量，結果見表2。

3 討論

3.1 代代花屬蕓香科植物酸橙的變種，參考《中國藥典》與枳實同屬，提取物代表成分為黃酮類的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和生物堿類的辛弗林，因此本研究同時使用上述對照品為指標，對代代花的質量進行了評價。通過對水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇等溶劑的考察，發現使用50%的甲醇作為溶劑，樣品的提取效率高，在對照品色譜圖中，色譜峰峰形對稱，理論塔板數高，分離效果好。通過考察超聲、回流等不同提取方法及提取時間，發現加入50%甲醇50 mL，加熱回流1 h，效果最佳，基本可以提取充分，且加樣回收試驗也驗證了方法的準確性。

表1 加樣回收率試驗結果（n=6）

表2 樣品含量測定（n=3）

3.2 由于辛弗林屬于生物堿類物質，極性較強，在一般液相條件下呈現極弱的保留，即使更換不同品牌、性質的色譜柱（如Agilent 公司的ZORBAX SBC18、Poroshell 120；Waters 公司的XBridgeTM C18；島津公司的Inertsil ODS-SP；Thermo 公司的Syncronis C18）仍然得不到很好的分離。經過摸索，發現流動相中加入0.1%十二烷基硫酸鈉，同時使用梯度洗脫可以使辛弗林的保留時間明顯延后，并且不影響柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的分離。在上述色譜柱上均可以使測定組分滿足分離要求。

3.3 根據4 種化合物紫外吸收波長的差別，并參照《中國藥典》柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷在283 nm、辛弗林在275 nm 有明顯吸收，且雜質干擾少，故利用二極管陣列檢測器的實時掃描功能，獲得所有波長下的色譜圖及即時的色譜圖，從而達到同時測定4種成分含量的目的。見圖2。

3.4 由于收集的樣品來自飲片市場，多見隔年貨或陳貨（該品為少用中藥），但是通過實驗發現，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林不僅含量較高，而且含量相對穩定，故可作為質量控制的指標。

圖2 紫外吸收光譜圖

3.5 近些年來，研究者對生物類黃酮進行了大量的研究。其是自然界中存在的酚類物質，屬植物的次級代謝產物，具有調節血脂、消除氧自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等生物活性。代代花中含有的黃酮類含量高于同科其他植物，其中橙皮苷、柚皮苷具有抗炎作用；所含的生物堿主要是辛弗林、N-甲基酪胺等，是升高血壓、抗休克的主要有效成分。未來開展代代花在食療、治療抑郁及代代花茶飲品方面會有較大的發展空間，為綜合利用代代花的資源，很有必要對其開展深入系統性研究。