利培酮片人體生物等效性研究

江蘇恩華藥業股份有限公司，徐州221007

利培酮（Risperidone）為苯異惡唑衍生物，具有較強的中樞5-HT,尤其是5-HT2A 和D2 受體的拮抗作用，臨床主要用于治療急性和慢性精神分裂癥，以及其它各種精神病性狀態的明顯的陽性癥狀和陰性癥狀[1]。帕利哌酮（Pallipiperidone）是利培酮在體內經CYP2D6 和CYP3A 酶轉化生成的代謝物[2]，藥理活性是利培酮的70%[3]，是利培酮片的臨床活性成分之一。本試驗建立了靈敏可靠的LC-MS/MS 方法檢測血漿中利培酮和帕利哌酮的濃度，計算空腹和餐后狀態下兩者的藥代動力學參數，以評估2 種利培酮片的生物等效性。

1 資料與方法

1.1 藥品與儀器

藥品：受試制劑（T）：利培酮片，江蘇恩華藥業股份有限公司，1 mg，含量98.8%，批號：S20 170604；參比制劑（R）：利培酮片，美國楊森制藥有限公司，1 mg，含量95.6%，批號：16DG442X；乙腈為分析純；試驗用水為超純水。

儀器：高效液相色譜儀，島津公司；質譜：Applied Biosystems/Sciex；數據采集：Analyst 1.6.2，Analyst 1.6.3，AppliedBiosystems/Sciex；數據處理：Watson LIMS 7.5 SP1，Microsoft Office 2007 或其他版本；MSA6.6s-000-DM 百萬分之一天平（賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.2 受試者選擇

本研究經中國醫學科學院皮膚病醫院倫理委員會批準。所有受試者均簽署知情同意書。

空腹和餐后試驗各48 名健康受試者，年齡18～42 歲；體重指數在19～26 kg·m-2；無異常的實驗室監查，無顯著的臨床癥狀；無不良嗜好；試驗前兩周內未使用任何藥物；本試驗服藥前一個月內未參加過任何藥物臨床試驗。

1.3 試驗設計

1.3.1 隨機分組方法 空腹及餐后研究均采用單劑量、開放、隨機、兩周期、兩序列自身交叉試驗設計。空腹及餐后研究各計劃入組48 例受試者，兩部分篩選及隨機分組方法一致，各部分均分兩批進行篩選和試驗，每批計劃入組24 名受試者。

第一批篩選合格的24 名受試者編號為001～024，若多于24 例，則作為備選者；第二批篩選合格的24 名受試者編號為025～048，若多于24 例，則作為備選者。每批分別采用區組隨機化方法產生的隨機表，將受試者隨機分為I 組和Ⅱ組。I 組受試者第一周期服用受試制劑（T），第二周期服用參比制劑（R）；Ⅱ組受試者第一周期服用R，第二周期服用T。

1.3.2 給藥及采血 給藥當天早晨已于隔夜空腹至少10 h。餐后組進食高脂高熱早餐，并在30 min內用餐完畢。于進餐后30 min 時服藥。第一周期I組空腹服用受試制劑1 mg，Ⅱ組空腹服用參比制劑1 mg；均約240 mL 溫開水送服。受試者服藥后保持半臥位約4 h。

在給藥前（服藥前60 min 內視為0 h）和服藥后10、20、30、45 min，1.00、1.33、1.67、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、5.00、6.00、8.00、10.00、14.00、24.00、36.00、8.00、72.00、96.00h 采集靜脈血，每次取血約4mL 至EDTA-2K 抗凝采血管中，搖勻，于采樣后1 h 內置2～8 ℃2000×g 離心10 min，分離血漿，低溫保存待測。

經約2 周的清洗期進行第二周期試驗。除藥物交叉外，其余試驗步驟同第一周期。

1.3.3 分析檢測 血漿樣本處理：精密取待測血漿50.0 μL 加入50.0 μL 的內標工作溶液（5.00 ng·mL-1/5.00 ng·mL-1，利培酮-d4/帕利哌酮-d4溶液），振搖1 min，加入200 μL 的乙腈，劇烈振搖約10 min，室溫條件下以4000 r·min-1離心10 min，取100 μL 上清液，用200 μL 超純水稀釋，充分振搖10 min 進行LC-MS/MS 分析。

色譜條件：Waters 色譜柱Atlantis T3（2.1×50mm，5 μm）；流動相A 含0.1%甲醛（FA）和5.00 mmol·L-1NH4Ac 的水溶液，流動相B 含0.1%FA 的乙腈（流動相梯度洗脫程序：0.00～3.00 min，A∶B=78%∶22.0%，3.10～3.60 min，A∶B=10%∶90.0%；3.70～5.00 min，A∶B=78%∶22.0%）；流速：0.400 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣體積5.00 μL。

質譜條件：電噴霧離子化，正離子模式，MRM，噴口電壓4000 V，氣簾氣壓力（CUR）241 kPa，霧化氣壓力（GS1）345 kPa，輔助氣壓力（GS2）345 kPa，離子源溫度（TEM）550 ℃，碰撞氣體CAD 9Unit。監測的反應離子對： 利培酮 ［MH］+m/z 411.2 →m/z 191.1，帕利哌酮［MH］+m/z 427.0→m/z 207.0；內標利培酮-d4［MH］+m/z 415.2→m/z 195.1；帕利哌酮-d4［MH］+m/z 431.2→m/z 211.1。

1.4 數據統計分析

藥動學參數采用WinNonlin 6.4 軟件進行統計分析，Cmax、Tmax均為實測值，AUC 用梯形法計算。采用BES，將Cmax、AUC0-t和AUC0-∞經對數轉換后進行方差分析（ANOVA），分析給藥序列間、制劑間、周期間差異的統計學意義。采用BES，將Cmax、AUC0-t及AUC0-∞在進行對數轉換后進行雙向單側t 檢驗，進行等效性評價。計算主要指標的幾何均值比率（受試制劑/參比制劑）的90%置信區間，如在等效區間（80.00%～125.00%），判斷為生物等效。同時計算參數的個體內變異系數和把握度。

2 試驗結果

2.1 方法學驗證

本試驗建立了檢測血漿中利培酮和帕利哌酮濃度的LC-MS/MS 法并進行了方法學驗證。利培酮的線性范圍為0.050 0～30.0 ng·mL-1，帕利哌酮0.050 0～15.0 ng·mL-1；利培酮的批內和批間精密度分別為8.6%和7.8%，準確度分別為-11.3%～4.2%和-4.0%～1.0%；帕利哌酮批內和批間精密度分別為6.6%和6.7%，準確度分別為-8.7%～7.6%和-2.7%～3.2%。利培酮和帕利哌酮及其內標的提取回收率均＞90.6%，精密度均＜3.0%。利培酮和帕利哌酮出峰位置干擾峰的平均響應值均不超過定量下限（LLOQ）標準曲線樣品平均響應值的10.3%，內標均不超出LLOQ標準曲線樣品平均響應值的0.1%，且利培酮與利培酮-d4，帕利哌酮與帕利哌酮-d4之間互相無干擾。利培酮和帕利哌酮的基質效應，包括溶血和高脂基質效應精密度均＜5.4%，準確度均在86.3%～101.1%。利培酮和帕利哌酮樣品離心分離前基質中待測物冰浴2.0 h 穩定，生物樣品前處理過程中室溫15.8 h穩定，制備后樣品8 ℃處理后樣品再進樣5 天20 小時穩定，-20 ℃/-70 ℃5 個凍融循環穩定，生物基質中-20 ℃61 天穩定，-70 ℃61 天穩定。以上表明，本試驗建立的LC-MS/MS 分析方法靈敏、可靠，可用于血漿中利培酮和帕利哌酮的濃度檢測。

2.2 藥動學參數

健康受試者在空腹和餐后狀態下口服受試制劑和參比制劑的平均血藥濃度-時間曲線圖見圖1和圖2，藥動學參數見表1 和表2。

圖1 空腹狀態下利培酮和帕利哌酮的平均血藥濃度-時間圖

2.3 生物等效性

圖2 餐后狀態下利培酮和帕利哌酮的平均血藥濃度-時間圖

表1 空腹狀態下利培酮和帕利哌酮的藥動學參數

設定利培酮片在人體內的藥動學參數Cmax的個體內變異系數為28%，AUC 的個體內變異為30%。在顯著性水平α=0.05、把握度（1-β）為80%下，以Cmax的個體內變異系數估算的最低所需受試者為40例，考慮到臨床試驗可能有一定的脫落，本試驗正式試驗計劃入組48 名受試者。

表2 餐后狀態下利培酮和帕利哌酮的藥動學參數

空腹試驗45 例志愿者完成了兩周期試驗，納入BE 集。脫落3 例：2 例第一周期服藥后，分別因擔心健康問題和嚴重不良事件中止試驗；第3 例因工作調動在第二周期開始前退出試驗。納入BE 集的45 例受試者的利培酮Cmax、AUC0-t和AUC0-∞在給藥序列間、制劑間、周期間的差異均無統計學意義。45 例受試者帕利哌酮Cmax和AUC0-t在給藥序列間、制劑間、周期間的差異均無統計學意義；44 例受試者帕利哌酮AUC0-∞在給藥序列間、制劑間、周期間的差異均無統計學意義。Tmax兩配對樣本的非參數檢驗Wilcoxon 符號秩檢驗表明差異無統計學意義。利培酮和帕利哌酮Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的幾何均值比值及其90%置信區間見表3。

表3 空腹狀態下利培酮和帕利哌酮Cmax、AUC0－t 和AUC0－∞經對數轉化后的（1～2α）置信區間

餐后試驗42 例志愿者完成了兩周期試驗，納入BE 集。脫落6 例：①1 例因家中有急事，于第一周期給藥當天凌晨離開I 期病房，未服藥；②有2 例第一周期結束至第二周期入住I 期病房前，未能聯系上，中止第二周期試驗；另1 例在清洗期自行用藥，因上呼吸道感染中止第二周期試驗；③還有2例在清洗期自行用藥，中止第二周期試驗。納入BE集的42 例受試者的利培酮Cmax、AUC0-t和AUC0-∞在給藥序列間、制劑間、周期間的差異均無統計學意義。42 例受試者帕利哌酮Cmax和AUC0-t在給藥序列間、制劑間、周期間的差異均無統計學意義；41 例受試者帕利哌酮AUC0-∞在給藥序列間、制劑間、周期間的差異均無統計學意義。Tmax兩配對樣本的非參數檢驗Wilcoxon 符號秩檢驗表明，差異無統計學意義。利培酮和帕利哌酮Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的幾何均值比值及其90%置信區間見表3。

2.4 安全性評價

本試驗的安全性評價指標含生命體征（包括血壓、脈搏及體溫）、體重、實驗室檢查及心電圖、不良事件等。空腹試驗受試制劑有40 例受試者共發生64 件不良反應，3 例低血壓嚴重程度為2 級，其余均為1 級；參比制劑有39 例受試者發生63 件不良反應，1 例暈厥嚴重程度為3 級，蛋白尿為2 級，其余均為1 級。餐后試驗受試制劑有39 例受試者共發生69 件不良反應，嚴重程度均為1 級；參比制劑有42 例受試者發生74 件不良反應，嚴重程度均為1 級。不良反應包括鎮靜、血催乳素異常、頭暈、血壓降低等。受試制劑和參比制劑總體耐受性良好。

3 討論

利培酮是臨床常用的治療精神分裂癥藥物，屬于基本藥物目錄品種。根據《國務院辦公廳關于開展仿制藥質量和療效一致性評價的意見》（國辦發〔2016〕8 號）要求開展一致性評價工作。帕利哌酮是利培酮的活性代謝物，具有良好的藥理活性，依據《以藥動學參數為終點評價指標的化學藥物仿制藥人體生物等效性研究技術指導原則》[4]，本試驗采用LC-MS/MS 同時檢測血漿中的利培酮和帕利哌酮濃度，以利培酮評價生物等效性，帕利哌酮的相關數據用于進一步支持臨床療效的可比性。

本研究比較了健康志愿者在空腹和餐后狀態下、口服1 mg 受試或者參比利培酮片后體內利培酮和帕利哌酮的藥代動力學，其得到的結果與已有文獻報道基本一致[5，6]，為后續研究提供了依據。

[1-2α]置信區間法計算得出空腹狀態下受試制劑和參比制劑利培酮的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的幾何均值比的90%置信區間分別為96.68%～109.80%、97.15%～109.62%、96.97%～109.28%，帕利哌酮分別為97.83%～105.49%、96.93%～105.11%、96.68%～105.42%；餐后狀態下利培酮分別為87.70%～105.54%、98.31%～109.01%、98.70%～109.95%，帕利哌酮分別為98.38%～105.54%、99.22%～106.28%、99.69%～106.54%。均滿足藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導原則中生物等效性的等效范圍要求（80.00%～125.00%），表明江蘇恩華藥業股份有限公司生產的利培酮片（1 mg）與原研Janssen Pharmaceuticals，Inc 生產的利培酮片具有生物等效性。