人工合成抗菌肽生物信息學分析及其抑菌活性研究

練家惠，陳向東，汪 輝，陳全順

中國藥科大學生命科學與技術學院微生物學教研室，南京210009

隨著抗生素的廣泛使用，抗生素濫用現象逐漸增多，耐藥菌的種類和數量也越來越多，給臨床治療帶來極大的挑戰，因此，迫切的需要新型抗菌藥物的研發來解決這一難題。抗菌肽（AMPs）是機體（動物、植物或微生物）在外界刺激誘導下，由特定基因編碼、合成的一類具有廣譜抗菌活性的陽離子多肽，是機體非特異性宿主防御系統的重要組成部分[1]。通過對AMPs 構效關系和作用機理的深入研究，結合生物信息學對天然抗菌肽進行定向優化或者從頭設計，有望設計出抗菌活性強、溶血性低、更優藥代動力學的AMPs。

Temporin-1Dra（HFLGTLVNLAKKIL-NH2）是一種從美國加利福尼亞紅腿蛙Rana draytonii 皮膚分泌物中提取分離出來的抗菌肽，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌具有較好的抑菌作用，但其較強的溶血性限制了臨床使用[2]。

本文主要對Temporin-1Dra 進行氨基酸替換，對改造之后的多肽序列進行生物信息學分析，以期獲得低毒性、對白色念珠耐藥菌株具有抑菌活性的AMPs，為解決臨床抗生素耐藥的新型抗菌藥物研發提供理論依據。

1 材 料

1.1 受試菌株

標準菌株：白色念珠菌（Canidia albicans ATCC 98001）、耐氟康唑（FLC）白色念珠菌均由中國藥科大學微生物學教研室提供。10 株Canidia albicans耐藥菌株，來自南方醫院臨床檢驗室所分離。

1.2 藥品和試劑

多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 委托常州康龍生物科技有限公司采用化學固相合成法而得，純度（HPLC）>95%；氟康唑（FLC，南京森貝伽生物科技有限公司）；Mueller-Hinton 瓊脂、肉湯培養基、Sabouraud Dextrose 瓊脂、肉湯培養基（北京三藥科技有限公司）。

1.3 儀器設備

KD20001A 電子天平（南京凱德計量儀表有限公司）；GHX-9080B 恒溫培養箱（上海福瑪實驗設備有限公司）；96 孔板 （Thermo Fisher Scientific 公司）；高壓滅菌鍋（日本Hirayama 公司）；潔凈工作臺（吳江市凈化設備總廠）；數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

2 方 法

2.1 多肽的生物信息學分析

抗菌肽的抑菌活性受其所帶電荷數的影響，有文獻報道，抗菌肽magainin 2 的電荷數從+3 增加到+5 時，對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的抑菌活性有所提高，若繼續增加正電荷數則會使其溶血性增加而抑菌活性卻沒有提高[3]。氨基酸的螺旋程度影響著抗菌肽的體內穩定性，人體可識別并且降解天然的L 型氨基酸，用D 型氨基酸對L 型氨基酸進行替換可以保護抗菌肽免受體內蛋白酶的識別和降解。研究表明，將天然抗菌肽 Temporin -1Dra（HFLGTLVNLAKKIL-NH2）第4、5、8 位的氨基酸分別用D 型K（賴氨酸）替換，改造之后的三條多肽序列均顯示出對白色念珠菌標準菌株有明顯抑菌活性，且溶血性有所降低[2]，但對耐藥菌株無作用。加之抗菌肽對細菌和真菌的抑菌機制大致相同，均可通過與帶負電荷的細胞膜相互作用發揮抑菌作用，因此對天然抗菌肽Temporin-1Dra（HFLGTLVNLAKKIL-NH2）進行了如下改造：將其4、5、8 位的氨基酸同時用D-賴氨酸進行替換，得到含有5 個正電荷的多肽序列：[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra（HFLKKLVKLAKKIL-NH2）。

運用生物信息學分析軟件CAMPR3、Prot-Param、SOPMA 分別對多肽序列[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 的抗菌肽形成概率預測，理化性質、二級結構進行預測[4，5]。

2.2 合成多肽溶血性測定

將無菌脫纖維羊血1000 g 離心5 min，取沉淀以pH 7.4 的磷酸緩沖液（PBS）洗滌3 次，再用PBS將其紅細胞濃度調整為1%；用生理鹽水將合成多肽濃度調整為512、256、128、64、32、16、8、4 μg·mL-1，加入等體積的紅細胞懸液，以PBS 為陰性對照組，以1% TritonX-100 為陽性對照。37 ℃作用1 h，1000 g 離心5 min，將上清液依次加入96 孔板，酶標儀測定吸光度A540nm值。每個濃度設置3 個平行。

溶血率 （%）=（A540nm樣品-A540nm陰性）/（A540nm陽性-A540nm陰性）×100%。當溶血率＞5%，認為有細胞毒性。

2.3 藥敏實驗

采用CLSI 規定的微量肉湯稀釋法體外測定多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 對Canidia albicans標準菌株、耐氟康唑白色念珠菌以及臨床分離Canidia albicans 耐藥菌株的MIC 值。

肉湯微量稀釋法對合成多肽和菌懸液進行稀釋，在96 孔板內合成多肽，最終濃度為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg·mL-1，無菌SD 肉湯培養基作為陰性對照，菌懸液作為陽性對照。于96 孔板37 ℃恒溫培養18 h，肉眼未見渾濁，孔中所對應的藥物最低濃度即為最小抑菌濃度（MIC）值。從未變混濁的孔中吸取培養物100 μL，均勻涂布到SD 瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養24 h，平板計數，按照最低殺菌濃度（MBC）規定：當平板中菌落數≤5 時，藥物濃度最低的即為MBC 值。

2.4 時間-殺菌曲線測定

采用菌落計數法測定合成多肽對耐FLC 白色念珠菌在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、24 h 的時間-殺菌曲線，多肽的濃度分別為2MIC、MIC、1/2MIC，同時設置FLC 對照組（濃度為MIC），空白生長對照組。

2.5 合成多肽與FLC 的聯合藥敏試驗

采用肉湯微量稀釋法進行合成多肽和FLC 對耐FLC 白色念珠菌的聯合藥敏實驗。選取7×7 棋盤，合成多肽和FLC 藥液濃度梯度制備和菌懸液制備，且藥液濃度的最高濃度設定為各自最小抑菌值的兩倍（2MIC），然后倍比稀釋至適當的濃度。96 孔板1-7依次為終濃度是32、16、8、4、2、1 μg·mL-1的FLC，AG 依次為終濃度是256、128、64、32、16、8、4 μg·mL-1的Linear-KL，每孔Linear-KL 和FLC 共計100 μL，然后加入100 μL 的菌懸液，同時設置含有200 μL 菌懸液的陽性對照組及含有200 μL SD 肉湯培養基的陰性對照組。然后用手輕敲96 孔板，使之混合均勻，放入37 ℃恒溫培養箱靜置培養18～24 h。

部分抑菌濃度指數 （fractional inhibitory concentration index，FIC index）是抗菌藥藥效學參數之一，FIC index=MIC（A）/MICA+MIC（B）/MICB，其中MIC（A）和MIC（B）分別代表A 藥和B 藥聯合用藥時各自的MIC 值，MICA 和MICB 分別代表A 藥和B 藥單獨用藥時的MIC 值。當FIC index≤0.5 時，藥物A 和B 之間有協同抗菌作用;當0.5＜FIC index≤1.0 時，藥物A 和B 聯合用藥的抑菌效果為相加作用；當1.0＜FIC index≤2.0 時，藥物A 和B 聯合用藥的抑菌效果為無關作用；當FIC index＞2.0 時，藥物A 和B 之間有拮抗作用，且2 種藥物聯合使用的效果顯著低于其中一種藥物單獨使用的效果。

3 結果

3.1 多肽生物信息學分析結果

氨基酸替換后的多肽序列：[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra（HFLKKLVKLAKKIL-NH2）。

多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 的抗菌肽形成概率預測、理化性質分析、二級結構分析，結果分別如表1、表2、圖1 所示。

由表1 可知，多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra的抗菌肽形成概率相對較高，理論證明其具有抗菌活性的可能性很大；由表2 可知，該條多肽為含有14個氨基酸、5 個正電荷的陽離子短肽，除此之外不穩定系數為-10.68，表明此多肽為穩定蛋白。由圖1 可知，其二級結構包括α-螺旋（6 個氨基酸殘基參與），占42.86%；延伸鏈（2 個氨基酸殘基參與），占14.29%；無規則卷曲（6 個氨基酸殘基參與），占42.86%。

表1 合成多肽的抗菌肽形成概率

表2 合成多肽的理化性質分析結果

圖1 合成多肽的二級結構預測

3.2 合成多肽溶血性測定

合成多肽溶血性測定結果如表3 所示。從表3中可以看出，溶血率隨著濃度的升高逐漸升高，多肽在128 μg·mL-1（MIC）范圍內溶血率＜5%，即使在高于MIC 值2～4 倍時，溶血率仍然低于10%，有輕微的溶血現象。

表3 合成多肽的溶血性測定

3.3 藥敏實驗

多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 的體外藥敏實驗結果如表4 所示。

表4 合成多肽的抑菌活性測定（MIC，μg·mL-1）

由表4 可知，合成多肽對Canidia albicans ATCC 98001 的MIC 值為64 μg·mL-1，對Canidia albicans耐藥菌株的MIC 值在64～128 μg·mL-1；對耐FLC 白色念珠菌的MIC 值和MBC 值均為128μg·mL-1。

3.4 時間-殺菌曲線繪制

多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 對耐氟康唑白色念珠菌的時間-殺菌曲線如圖2 所示。

圖2 [G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 時間-殺菌曲線

由圖2 可知，在0～3 h 內，在2MIC、MIC、1/2MIC 濃度下多肽對耐藥菌株具有明顯的抑制作用，且隨濃度的增加殺菌效率逐漸增強。在MIC 濃度下，[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 的殺菌速率強于氟康唑對照組。

3.5 多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 與FLC 的聯合藥敏試驗

多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 和耐FLC 白色念珠菌的聯合抑菌結果如表5 所示。

表5 合成多肽和FLC 的聯合抑菌結果（MIC，μg·mL-1）

由表5 可知，聯合用藥時合成多肽和FLC 的MIC 分別為16 μg·mL-1、4 μg·mL-1，根據公式：FIC index=MIC（A）/MICA+MIC（B）/MICB。

部分抑菌濃度指數 （FIC index）=0.375，FIC 指數≤0.5，即多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 和FLC之間有協同抗菌作用。

4 討論

以天然抗菌肽Temporin-1Dra 為模板，將其第4、5、8 位的氨基酸同時用D 型氨基酸進行替換，得到含有5 個正電荷的陽離子多肽序列：[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra （（HFLKKLVKLAKKIL-NH2）。對改造之后的天然抗菌肽進行生物信息學分析，發現其抗菌肽形成概率相對較高；溶血性測定表明，其在128 μg·mL-1（MIC）范圍內溶血率＜5%，無細胞毒性；體外抑菌活性檢測結果表明，對白色念珠菌耐藥菌株的MIC 值在64～128 μg·mL-1，故成功設計出一條溶血性低且對白色念珠菌耐藥菌株有抑制作用的抗菌肽。

在全球范圍內，念珠菌每年造成4000 萬例感染病癥，白色念珠菌是其主要的感染病原體，所占念珠菌感染病的50%～70%。白色念珠菌是一種存在于人類皮膚、黏膜以及腸道中的條件致病真菌，可導致機體淺表和深部的白色念珠菌病乃至菌血癥[6]。唑類藥物氟康唑（FLC）可通過口服或靜脈給藥，用來治療口腔、皮膚、陰道等淺表皮膚念珠菌感染，但隨其廣泛使用，FLC 耐藥菌株不斷增加[7]。從[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 對耐FLC 白色念珠菌的殺菌曲線可以看出，多肽在3 h 內、MIC 濃度下具有顯著的殺菌效率，且效果優于FLC 對照組；與FLC 的聯合藥敏實驗結果表明，兩者聯合具有協同殺菌作用，可明顯降低對耐FLC 白色念珠菌的MIC值。推測抗菌肽可通過靜電相互作用與真菌細胞膜相結合，在細胞膜上形成孔洞導致細胞內內容物外漏，接下來可對[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 的抑菌機制進行深入的探究。

抗生素耐藥嚴重威脅著人類的健康，多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 的設計和研究，為開發出針對臨床白色念珠菌耐藥菌株的新型抗菌藥物提供了又一參考。