復方銀花解毒顆粒對干酵母誘導幼鼠發熱模型的退熱作用研究

儲 錦，馬星月，秦婷婷，馬占強，傅 強，馬世平

中國藥科大學中藥學院，南京211198

復方銀花解毒顆粒是由青蒿、山銀花、荊芥、薄荷、野菊花、大青葉、連翹、鴨跖草、前胡、淡豆豉等中藥制成的顆粒劑，能疏風解表、清熱解毒。用于感冒引起的發熱、頭痛、咳嗽等，臨床前研究表明，復方銀花解毒顆粒對傷寒、副傷寒、變形桿菌和大腸桿菌內毒素所致的發熱家兔有解熱作用。為了驗證該復方對幼齡模型動物的藥效作用，本項目以幼齡大鼠為研究對象，采用干酵母混懸液誘導幼齡大鼠發熱模型，觀察其退熱作用，為該產品臨床擴大用藥人群至兒童提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級3～5 周齡幼年雄性SD 大鼠200 只，體重在50～70 g，由江蘇省青龍山實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（浙）2019-0002，實驗動物質量合格證號1907040008。

1.2 藥物和試劑

復方銀花解毒顆粒 （天長億帆制藥有限公司，批號180911）；布洛芬（葵花藥業，批號29180412）；干酵母（OXOID 公司，批號2481359-02）；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、cAMP ELISA 試劑盒（均為Elabscience）；內參GAPDH（Proteintech 公司，批號00078425）；一抗核因子κB（NF-κB，批號8424S）、p-NF-κB（批號3033T） 購自Cell Signaling Technology 公司；p-IκB（萬類生物科技公司，批號H01022495）；環氧化酶2（COX2，Proteintech 公司，批號00072808）；兔二抗（Bioworld，批號AA01201）；ECL 化學發光超敏顯色試劑盒 （上海翊圣生物科技有限公司，批號36208ES60）；PMSF（批號ST505）、RIPA 裂解液（強）（批號P0013B）、5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（批號P0015L）、BCA 試劑盒（批號P0010），均為碧云天生物技術有限公司。

1.3 實驗儀器

電子體溫計 （山東尚農電子科技有限公司）；SN3001 全波長多功能酶標儀（Thermo 公司）；全自動數碼凝膠/化學發光圖像分析系統、EPS 600 電泳儀（均上海天能科技有限公司）；TE124S 精密電子天平（Sartorius 公司）。

1.4 模型制備與分組給藥

將SPF 級3～5 周齡幼年雄性SD 大鼠，適應性喂養3 天，每日早中晚各一次對幼鼠進行測量肛溫，每次測溫前電子體溫計探頭涂上凡士林，插入幼鼠直腸2.5 cm（在體溫計2.5 cm 用黑色記號筆標記，確保每次插入深度一致），待讀數穩定后記錄體溫值，連續測量3 天，選取體溫為36.5 ℃～38.5 ℃、且連續體溫變化小于0.3 ℃的動物用于實驗[1]。

將篩選合格的幼鼠隨機分成空白對照組、模型組、布洛芬組（0.6 g·kg-1）以及復方銀花解毒顆粒低中高劑量組（2.5、5、10 g·kg-1）。

第一批幼鼠每組12 只，用于體溫檢測。第二批幼鼠每組8 只，用于機制研究，在藥效顯著時取血及下丘腦。連續灌胃給藥7 天阿，空白和模型組給予同體積生理鹽水。

實驗開始前，禁食不禁水6 h，于實驗當天早上檢測體溫3 次，取均值為基礎體溫，末次給藥1 h 后各組動物以10 mL·kg-1劑量皮下注射質量濃度為200 mg·L-1的干酵母混懸液；空白對照組皮下注射等體積生理鹽水[1]。

1.5 肛溫測試、標本的采集及檢測

第一批動物造模后0.5、1、2、3、4、6 h 分別測定肛溫，記錄數據，與基礎體溫比較，計算體溫變化值（△℃）（測定體溫-基礎體溫）。在第二批動物造模后選擇藥效顯著的時間點，從動物腹主動脈取血，處死后取下丘腦。ELISA 檢測該時間點血清中內生致熱源IL-1β、IL-6、TNF-α 含量。試劑盒檢測下丘腦體溫調節介質cAMP 含量。

1.6 Western blot 檢測信號通路相關蛋白表達

Western blot 檢測下丘腦炎癥信號相關COX2的含量，并檢測NF-κB 的核轉錄情況及IκBα 磷酸化水平變化。根據所提下丘腦組織的重量，取所需量的RIPA 裂解液。在使用前加入苯甲基磺酰氟（PMSF），配成裂解緩沖液。按比例加入裂解緩沖液于勻漿器中研磨至組織裂解。收集組織勻漿于離心管中，4 ℃放置30 min，充分裂解后，離心（12 000 r·min-1，4 ℃）30 min，收集上清液。取2 μL 上清液用于檢測蛋白的濃度，其余上清液中加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，于100℃沸水浴中加熱10min 使蛋白完全變性。室溫冷卻，樣品制備結束進行制膠和SDSPAGE 電泳。參照marker 將目的蛋白所在凝膠切下，采用濕法轉膜，室溫封閉2h。封閉結束后，取出PVDF膜，用TBST 洗滌1 次。將PVDF 膜蛋白面朝下放入TBST 稀釋的一抗中，4℃孵育12h 后，將PVDF 膜轉移至TBST 中洗滌3 次。然后在二抗中37℃輕輕搖晃孵育2 h，TBST 洗滌2 次。在PVDF 膜上加入ECL化學發光超敏顯色劑，在全自動數碼凝膠/化學發光圖像分析系統中顯影并采集圖像。使用Image J 圖像分析軟件對采集到的圖像進行灰度分析。

1.7 統計學方法

采用GraphPad Prism 5 軟件，單因素方差分析統計各項數據。P＜0.05 為具有統計學顯著性差異。

2 結果

2.1 對干酵母致幼鼠發熱體溫變化的影響

如圖1 所示，與空白對照組比較，模型幼齡大鼠造模后3、4、6 h 體溫顯著升高（P<0.001，P<0.01，P<0.001），造模3 h 時模型幼鼠體溫達到最高。與模型組相比，布洛芬組在3 h 時體溫降低顯著 （P<0.05）；復方銀花解毒顆粒低劑量組、中劑量組在造模后3 h 體溫有降低趨勢、但是沒有統計學差異；復方銀花解毒顆粒高劑量組在造模后2、3 h 體溫明顯降低，具有統計學意義（P<0.01、P<0.001）。

圖1 各時間點發熱幼鼠體溫變化曲線（n=12）

2.2 對干酵母致熱幼鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響

如圖2 所示，與空白對照組比較，模型組IL-6、IL-1β、TNF-α 含量均顯著升高（P<0.01、P<0.01、P<0.001）。與模型組比較，布洛芬組可降低血清中各炎癥因子的水平，其中IL-6 水平的降低具統計學意義。與模型組比較，復方銀花解毒顆粒低劑量組能顯著降低IL-6、IL-1β 含量（P<0.01、P<0.01）；復方銀花解毒顆粒之中劑量組、高劑量組可降低IL-6、TNF-α 含量，具有統計學差異（P<0.05、P<0.05）。

2.3 對下丘腦cAMP 含量的影響

如圖3 所示，與空白對照組比較，模型組下丘腦內cAMP 含量顯著升高（P<0.001）。布洛芬組、復方銀花解毒顆粒低劑量組、高劑量組均能顯著降低幼鼠下丘腦內cAMP 含量（P<0.001、P<0.001）。

2.4 對下丘腦NF-κB、IκBα、COX2 蛋白表達的影響

圖2 對幼鼠血清內IL-6、IL-1β、TNF-α 含量的影響

圖3 對下丘腦內cAMP 含量的影響

如圖4 所示，與空白對照組比較，模型組下丘腦內NF-κB、IκBα、COX2 含量均顯著升高，具有統計學意義（P<0.001、P<0.001、P<0.01）。與模型組比較，布洛芬組能夠顯著降低下丘腦內NF-κB、IκBα、COX2含量（P<0.05、P<0.05、P<0.05）。復方銀花解毒顆粒組高劑量下丘腦內NF-κB、IκBα、COX2 蛋白表達量與模型組相比也顯著下降（P<0.001、P<0.05、P<0.01）。

3 討論

圖4 對下丘腦內NF-κB、IκBα、COX2 含量的影響

復方銀花解毒顆粒以“銀翹散”為基礎化裁而來，方中以山銀花、連翹為君藥：山銀花味甘性寒，氣味芳香，具有清熱解毒之功，善治溫病發熱等病證；連翹苦而微寒，輕清上浮；兩藥既能解表透邪，又能清熱解毒。臣藥用荊芥、薄荷、豆豉疏散解表：荊芥雖屬辛溫之品，但溫而不燥伍入辛涼清解劑中，可以加強解表透邪之力，方中用此藥，涼而又辛；薄荷辛涼，疏散風熱而利咽喉；豆豉辛甘微苦弱寒，宣散表邪；共助君藥開皮毛而散熱于外。佐藥為青蒿、大青葉、野菊、鴨跖草：青蒿苦寒清熱，芳香透邪；大青葉味苦性寒，清熱涼血，尤擅長于清解時祛之熱毒；野菊花味苦辛性微寒，清熱解毒；鴨跖草味甘性寒，清熱解毒，而尤以解熱見長。使藥前胡辛苦，宣散風熱，肅肺化痰。諸多中藥合用具有辛涼解表、清熱解毒之功。現代藥理學研究表明，本品具有較好的抗病毒、抗菌、解熱、鎮痛和抗炎作用。方中含多樣青蒿化學成分，包括倍半萜、二萜、黃酮類等。其中倍半萜類是青蒿發揮作用的主要有效成分，具有多種藥理作用，尤顯解熱抗炎等[2]。已有研究表明，青蒿中多個成分均能降低酵母引起的大鼠體溫異常升高，有解熱作用[3]。山銀花主要活性成分之一為綠原酸，有抗菌、抗炎、抗病毒等作用[4]。荊芥主要成分為揮發油及黃酮類化合物，可以祛風解表，有解熱、抗炎鎮痛等作用[5，6]。

cAMP 是重要的發熱中樞介質，研究表明，下丘腦內cAMP 的濃度隨著體溫的升高而升高，與體溫呈正相關[7]。IL-6、IL-1β、TNF-α 是研究明確的炎癥因子，多項研究表明，在體溫異常升高時，上述炎癥因子水平也呈現上升趨勢[8-10]。

本研究發現，模型組體溫在造模后3 h 升高最明顯，此時復方銀花解毒顆粒高劑量組降低體溫效果也極顯著，表明該顆粒劑有解熱的功效。在對比模型組血清中炎癥因子水平后發現，復方銀花解毒顆粒能顯著降低IL-6、IL-1β、TNF-α 含量。復方銀花解毒顆粒也可顯著減少幼鼠下丘腦內cAMP 含量，提示該顆粒劑具有解熱功效。其作用機制與降低腦內cAMP 水平、降低各種炎癥因子水平有關，并且高劑量組效果最明顯。

在本研究中，復方銀花解毒顆粒之中劑量組對發熱幼鼠下丘腦內cAMP 含量有降低趨勢、但是沒有顯著性差異，其原因可能是中劑量組降低體溫作用較弱，與模型組相比沒有顯著性差異，從而導致cAMP 含量沒有顯著降低；另外，中藥發揮作用的機制復雜，在幼齡大鼠體內可能較難表現出劑量依賴性。復方銀花解毒顆粒中、高劑量組有降低血清IL-1β 含量的趨勢、但是沒有統計學差異，其可能的原因是幼鼠體內的IL-1β 因子對低劑量組更敏感，中高劑量抑制IL-1β 效果沒有低劑量組好，其確切作用機制有待深入研究。

NF-κB 是一種可誘導的真核轉錄因子，在調控眾多參與免疫和炎癥反應的基因表達中起著關鍵作用[11]。在正常情況下，NF-κB 與其抑制性蛋白IκBs 結合形成異三聚體而失去活性[12]。當細胞受外界炎癥因子刺激后，NF-κB 的抑制蛋白（IκBα）可發生磷酸化并降解，NF-κB 從NF-κB/IκBα 復合物中解離出來，發生了活化并入核，誘導相關炎癥基因的表達[13]。進入細胞核后，NF-κB 可以調節幾個基因，其中包括COX2。COX 是產生前列腺素（PGs）的關鍵酶，會引起一系列的炎癥反應[11]。有研究表明，干酵母皮下注射引起大鼠發熱后，可激活NF-κB p65 并入核起到轉錄作用，促進下丘腦COX2 mRNA 表達增加[8]。

本研究發現，復方銀花解毒顆粒以及布洛芬均可以通過抑制NF-κB 的活化減少其入核，抑制COX2 活性，從而減少炎癥物質的產生，發揮解熱作用。同時也可以通過減少IκBα 的磷酸化、抑制NFκB 激活，從而發揮解熱、抗炎效果。

綜上所述，復方銀花解毒顆粒對幼鼠發熱模型有較好的解熱抗炎作用，使得異常升高的體溫恢復正常，可顯著降低模型動物體內炎癥因子水平，其機制可能與cAMP 信號轉導通路和NF-κB 信號通路有關。