腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155、XpertMTB/RIF水平在結核性腦膜炎診斷中的價值

孫萬里 魯增輝 蔡華鋒 周倩倩 馬苑 王月

結核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是一種常見非化膿性炎癥性疾病，由結核分枝桿菌感染神經系統所致，TBM發病率占全身結核病的6%，是肺外結核中最為嚴重的一類，致殘率、致死率高，嚴重危害患者生命安全[1]。TBM早期癥狀不明顯，腦脊液常規、生化改變不典型，易造成誤診和漏診[2]。顱腦CT、MRI檢查特異性低，涂片檢查耗時長、靈敏度低且漏診率高[3]。因此尋找敏感、特異指標對TBM早期診斷非常重要，對及時治療、改善患者預后意義重大。腺苷酸脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)是嘌呤代謝中重要酶類，與機體細胞免疫活性有關，結核分枝桿菌感染后，可引發機體免疫功能紊亂，釋放ADA[4]。γ-干擾素(interferonγ，IFN-γ)是免疫反應中關鍵細胞因子，可促進細胞免疫應答，在TBM免疫反應中發揮重要作用[5]。近來體液中微小RNA(microRNA，miRNA)成為一種新型診斷標志物，有研究報道mir-155在結合分枝桿菌誘導巨噬細胞凋亡中其重要作用[6]。結核性腦膜炎/利福平耐藥基因檢測(XpertMTB/RIF)是由美國Cepheid公司研發的一種新型TBM及利福平耐藥診斷技術，目前在臨床上備受關注[7]。因此本研究擬探究腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155聯合XpertMTB/RIF檢測在結核性腦膜炎診斷中的價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2019年1月本院收治的200例TBM患者為觀察組，男103例，女97例；年齡18～75歲，平均年齡(42.75±11.58)歲。另取同期在本院進行腦脊液檢查并經組織學、影像學技術確診的非中樞系統疾病患者200例為對照組，男105例，女95例；年齡19～73歲，平均年齡(41.64±10.95)歲。2組患者性別比、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。所有樣品采集及資料調查取得患者及其家屬知情同意并簽字確認，本研究經過本院道德倫理委員會批準通過，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①符合結核性腦膜炎的診斷標準[8]；②臨床資料完整；③自愿配合調查研究。

1.2.2 排除標準：①細菌、真菌、病毒等引起中樞系統感染者；②患有惡性腫瘤者；③肝、腎等重要臟器功能障礙者；④臨床資料不全者。

1.3 主要試劑及儀器 Trizol試劑(貨號：R0016，上海碧云天)； PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)(編號：RR037A，TaKaRa)、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(編號：6210A，TaKaRa)；人ADA ELISA試劑盒(貨號：貨號 PA1-27246，美國Invitrogen)人IFN-γELISA試劑盒(貨號：PT518，上海碧云天)；引物由廣州銳博生物工程有限公司合成；紫外分光光度計(美國 Thermo Fisher公司)、RT-qPCR儀7500(美國Bio-Rad公司)等。

1.4 方法

1.4.1 腦脊液采集:無菌條件下，對受試者行腰椎穿刺，取腦脊液3 ml，3 000 r/min，有效離心半徑10 cm，離心10 min，置于-80℃保存待檢。

1.4.2 腦脊液細胞學檢查:采用Olympus AV640 全自動生化儀檢測腦脊液中白細胞計數、中性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞比例。

1.4.3 腦脊液生化指標檢查:采用FCS IV型微型腦脊液細胞玻片離心沉淀器(Thermo Fisher，美國)檢查腦脊液中糖、氯化物及蛋白質含量。

1.4.4 腦脊液ADA、IFN-γ水平檢測:采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測腦脊液ADA、IFN-γ水平，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.5 腦脊液mir-155水平檢測:采用Trizol提取腦脊液總RNA，用紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度。反轉錄得到cDNA，置于-20℃保存備用。采用實時定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測mir-155表達水平。RT-qPCR采用20 μl反應體系：TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μl，ROX Reference Dye or Dye II(50×)0.4 μl ，cDNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.0 μl。反應采用兩步法，條件設置為：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，34 s，40個循環；添加溶解曲線。mir-155上游引物(5’→3’)：ACACTCCAGCTGGGCTCCTACACATATT，mir-155下游引物(5’→3’)：CTCAACTGGTCGTGGA。內參U6上游引物(5’→3’)：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，U6下游引物(5’→3’)：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。采用2-ΔΔCT法對腦脊液中mir-155的相對表達水平進行定量分析。

2 結果

2.1 2組患者腦脊液細胞學檢查結果比較 與對照組比較，觀察組患者腦脊液中白細胞計數、中性粒細胞比例顯著增加，淋巴細胞及單核細胞比例顯著減少，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組腦脊液細胞學檢查結果比較

2.2 2組患者腦脊液生化指標檢查結果比較 與對照組比較，觀察組患者腦脊液中糖、氯化物濃度顯著降低，蛋白質濃度顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者腦脊液生化指標檢查結果比較

2.3 2組患者腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平比較 與對照組比較，觀察組患者腦脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平均顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平比較

2.4 腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平單獨檢測及XpertMTB/RIF檢測對TBM診斷價值比較 分別以腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平為檢測變量繪制ROC曲線，結果顯示腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平診斷TBM的AUC分別為0.824、0.827、0.785，靈敏度分別為81.00%、90.50%、74.00%，特異度分別為86.00%、77.00%、70.00%。以臨床診斷為金標準，四格表分析顯示，XpertMTB/RIF檢出TBM的靈敏度為57.00%，特異度為91.00%。見表4，圖1。

圖1 ROC曲線腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平對TBM的診斷價值

表4 四格表分析XpertMTB/RIF對TBM的診斷價值 例

2.5 腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平聯合XpertMTB/RIF檢測對TBM診斷價值分析 將腦脊液ADA或IFN-γ或mir-155或XpertMTB/RIF檢測TBM陽性規定為聯合診斷陽性。腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平聯合XpertMTB/RIF診斷TBM靈敏度為93.00%，特異度為91.00%。見表5。

表5 腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155聯合XpertMTB/RIF檢出TBM的四格表 例

3 討論

生理情況下，中樞神經系統存在血-腦脊液屏障，腦脊液被封閉在蛛網膜下腔，機體血液中蛋白質、糖及氯化物等物質可選擇性透過血-腦脊液屏障進入腦脊液[9]。機體感染結核分枝桿菌時，腦膜、脈絡叢和室管膜會發生炎性反應，造成腦脊液生成增多，蛛網膜顆粒吸收下降，血-腦脊液屏障受損，通透性增加，血液中蛋白進入腦脊液增多，糖代謝發生紊亂，腦底處破裂結核結節周圍包含大量多核型白細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等物質的滲出物向蛛網膜下腔擴散[10]。本研究結果發現TBM患者腦脊液中白細胞計數、中性粒細胞比例顯著增加，淋巴細胞及單核細胞比例顯著減少，提示TBM患者存在白細胞和中性粒細胞、蛋白質顯著增多，淋巴細胞、單核細胞、糖及氯化物減少癥狀，符合TBM診斷標準。

機體感染結核分枝桿菌后，在巨噬細胞抗原提呈作用下，通過T淋巴細胞產生免疫應答反應，釋放IFN-γ，IL-2等大量淋巴因子，其中IFN-γ在結核分枝桿菌感染的免疫反應中起重要作用[2]。張燕等[11]研究發現，TBM患者腦脊液中IFN-γ水平顯著增加。吳長靜[2]研究發現，結核分枝桿菌感染患者誘導T細胞IFN-γ釋放反應，導致腦脊液IFN-γ水平顯著升高。ADA是腺嘌呤核苷酸代謝關鍵酶，可催化腺苷生成肌苷，經尿酸排出體外。結核分枝桿菌感染突破血-腦脊液屏障后，刺激中樞神經局部免疫系統T細胞增殖、分化，可導致腦脊液中ADA活性升高[12]。湯海燕等[9]研究報道，結合分枝桿菌感染可引起腦脊液中ADA水平增加。mir-155位于非編碼轉錄體bic外顯子，通過調節T細胞分化、參與炎癥及免疫應答反應[13,14]。柴璐璐等[6]研究發現，miR-155-5p在TBM患者腦血漿中表達上調。本研究結果發現，TBM患者腦脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平均顯著高于對照組。綜合以上研究及本研究結果提示腦脊液中ADA、IFN-γ、mir-155可能是TBM相關敏感指標，TBM患者免疫應答反應中T細胞增殖分化可能導致腦脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平升高，但對TBM的診斷價值有待進一步研究。

王永峰等[15]研究報道，動態監測腦脊液ADA水平可作為評價TBM患者預后質量的重要指標。楊澤偉等[3]研究報道，腦脊液ADA、IFN-γ對TBM有一定診斷價值。Wu等[16]研究報道，mir-155在TBM患者腦脊液中表達水平升高，有潛力成為TBM敏感診斷標志。XpertMTB/RIF是一種新型TBM診斷技術，可同時檢測TBM和利福平耐藥。研究發現，XpertMTB/RIF對痰標本具有較高的靈敏度和特異度，對肺結核診斷價值較高，但對肺外結核診斷價值研究較少[17,18]。本研究分析發現腦脊液ADA水平診斷TBM靈敏度低，IFN-γ診斷TBM特異度低、mir-155水平及XpertMTB/RIF檢測診斷TBM靈敏度和特異度均不佳。因此本研究進一步對腦脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平聯合XpertMTB/RIF對TBM的診斷價值進行分析，結果發現，靈敏度為93.00%，特異度為91.00%，顯著高于單獨檢測的靈敏度及特異度，提示腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平聯合XpertMTB/RIF檢測可提高對TBM診斷的靈敏度和特異度，對TBM診斷有一定臨床價值。

綜上所述，腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平聯合XpertMTB/RIF檢測可提高對TBM診斷的靈敏度和特異度，對TBM診斷有一定臨床價值。但由于本研究樣本量少，結果可能具有局限性，腦脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平聯合XpertMTB/RIF檢測是否可應用于TBM臨床診斷，尚需擴大樣本量進一步驗證。