高通量測序對自然流產胚胎染色體異常的分析

張攀 孫艷美 張萍萍 馬聰 苗繪 李亞麗

自然流產的臨床發生率10%～15%，超過80%的自然流產發生在妊娠早期[1]。目前自然流產的發病機制尚不清楚，導致自然流產的因素包括遺傳、內分泌、感染、解剖因素及母體自身免疫系統疾病等，其中遺傳因素尤其是胚胎染色體異常是自然流產發生的主要原因，約占早期自然流產的50%[2]。研究發現70%的偶發性流產是由胚胎染色體異常引起的[3]。本研究通過高通量測序及傳統G顯帶技術對自然流產組織物進行了細胞遺傳學分析，探討不同檢測方法的優缺點，為臨床遺傳咨詢提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年9月至2017年3月于河北省人民醫院生殖遺傳科就診的自然流產患者192例為研究對象，平均流產年齡(29.40±4.18)歲，終止妊娠平均孕齡(9.23±2.53)周?；颊呔洺暣_認宮內妊娠，并提示胚胎停止發育，且排除外傷、感染、發熱等因素所致，在充分實驗告知并簽署知情同意書的原則下，于無菌條件下采取胚胎絨毛組織，進行高通量測序或細胞遺傳學G顯帶檢測。

1.2 方法 經研究對象本人簽署知情同意書后采集絨毛組織標本，收集刮宮后的絨毛組織，用0.9%氯化鈉溶液充分洗滌絨毛組織至無明顯血液殘留，取新鮮標本送檢或-80℃冰箱保存備用。

1.2.1 細胞遺傳學G顯帶

1.2.1.1 試劑與儀器:主要試劑包括秋水仙素100 μg/ml(Sigma公司)，主要儀器包括TGL-16G臺式離心機(上海醫用分析儀器廠)、恒溫水浴箱(上海市醫療器械一廠)、恒溫培養箱(NBS公司)、Leica全自動染色體分析系統(德國Leica公司)。

1.2.1.2 實驗步驟:選取10 mg左右優質絨毛組織放入37℃的無菌加微量肝素0.9%氯化鈉中沖洗2～3次，與預溫37℃含秋水仙素濃度為0.1～0.4 μg/ml的1%枸櫞酸鈉5 ml充分混勻，并進行30 min低滲。低滲完成后加入1 ml甲醇：冰醋酸(3∶1)，混勻5 min進行預固定，然后換新鮮固定液置室溫固定30 min。棄去固定液，順管壁加入60%冰醋酸1 ml，1～2 min后，由管底部緩緩加入甲醇3 ml，輕輕混勻，固定5 min時用滴管將絨毛挑出，再離心5 min去上清液。加入2～3滴新鮮固定液，輕輕混勻，以冰片進行滴片，然后立即于60℃烤箱內放置16～24 h或置于37℃下72 h，待其自然冷卻后即可進行姬姆薩染色顯帶；顯帶完成后進行染色體核型分析：每張片子顯微鏡下計數20 個中期分裂相，分析2個細胞核型，記錄染色體數目和結構畸變；如是嵌合型病例，每個細胞系至少分析2個細胞。

1.2.2 高通量測序

1.2.2.1 試劑與儀器:主要試劑包括Next DNA雙鏈片段化酶(M0348S，NEB)、QIAamp DNA Blood Mini Kit 核酸提取試劑盒(51104，QIAGEN)、胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T T13)檢測試劑盒(320020-01，博奧生物)、QubitTMdsDNA HS Assay Kit(Q32851，Thermo fisher)。主要儀器包括PCR儀(Veriti，ABI)、Thermomixer(Thermomixer comfort，Eppendorf)、低溫離心機(5804R，Eppendorf)、低溫高速離心機(5424R，Eppendorf)、熒光定量PCR儀(Stepone plus，ABI)、測序儀(BES4000，博奧生物)、Nanodrop分光光度儀(Nanodrop one，Thermo fisher)、濃度測定儀(Qubit 3.0，Thermo fisher)。

1.2.2.2 實驗步驟:取胎兒絨毛組織100 mg，用PBS或0.9%氯化鈉溶液清洗3～5次，通過QIAamp DNA Blood Mini Kit核酸提取試劑盒提取全基因組DNA，并對提取的樣品進行質控檢測，應用Qbuit、Nanodrop one對DNA質量進行檢測，確保DNA濃度不低于30 ng/μl，260/280值在1.8～2.0，沒有蛋白、多糖和RNA污染，沒有降解。采用酶切法，將樣品DNA酶切成100～200 bp大小的片段。使末端修復酶將片段化后形成的粘性末端DNA修復成平末端，然后用磁珠法純化產物。使用DNA連接酶給末端修復后DNA兩端加上P1接頭和特異標簽，然后用磁珠法純化產物。通過PCR技術(10個循壞)擴增兩端帶有接頭和標簽的DNA片段；上述步驟反應后的DNA使用磁珠法純化產物。使用QPCR檢測文庫濃度，確保濃度>5 nmol/L。構建好的文庫經QPCR檢測合格后，將一定量的文庫按照等物質的量混合，然后在BES4000上測序。數據分析：基于拷貝數變異的檢測方法，引入GC校正和LOSS校正，用博奧自主開發的比對軟件，將每個讀長的測序堿基與人類基因組參考序列(hg19)進行比對，對比對上的讀長數據進行染色體異常分析。

1.3 分組 對檢測成功的146例進行分組。(1)根據年齡分為20～24歲，25～29歲，30～34歲，35～39歲，≥40歲5個亞組。(2)根據根據自然流產次數：自然流產1次66例，自然流產2次46例，自然流產≥3次34例。(3)根據自然流產孕周分為：<8周16例，8～11+6周106例，≥12周15例，另有缺失8例。

2 結果

2.1 絨毛染色體G顯帶及染色體核型分析 共收集192例自然流產患者的胚胎組織,61例進行絨毛染色體G顯帶，檢測成功15例，成功率為24.6%，在培養成功中發現異常核型8例(53.3%)，其中染色體非整倍體4例(47,XN,+22，47,XN,+2，47,XN,+7，47,XN,+9)，46,XN,+mar 1例，三倍體2例，四倍體1例。

2.2 高通量測序檢測結果 應用高通量測序測序131例，所有樣本檢測成功，檢測成功率為100%，顯著高于絨毛染色體G顯帶技術(χ2=129.912，P<0.05)。發現異常核型57例(43.5%)，其中非整倍體50例，單體11例，三體39例，單體主要為45,X，此外還有21單體1例。最常見的非整倍體異常核型為16-三體13例(22.8%)，45,X 10例(17.5%)。在57例染色體異常核型中，結構異常7例，平均流產孕周為(9.87±1.79)周，且主要集中在4號、8號染色體的微缺失、微重復，其中病例1所示結果為重復、缺失嵌合型，為非已知致病變異，其他6例均涉及到已知的致病基因，該序列缺失或重復可以引起生長遲緩、智力低下、結構異常等。見表1。

表1 7例染色體結構異常核型

2.3 2種檢測技術比較及異常染色體核型分析 綜合兩種技術方法192例自然流產患者中146例流產組織染色體核型檢測成功，其中胚胎染色體核型異常率占44.5%(65/146)，染色體數目異常占89.2%(58/65)。其中，非整倍體55例，單體11例，三體44例，多倍體3例，雙重三體2例，嵌合體5例，結構異常8例。最常見的非整倍體異常核型為16-三體20%(13/65)，45,X約占15.4%(10/65)。見表2。

表2 146例自然流產染色體異常核型分析

2.4 孕婦年齡、自然流產次數、自然流產孕周與染色體異常 146例自然流產孕婦中，根據年齡分為5個亞組，年齡≥40歲組的染色體異常核型發生率最高，年齡25～29歲組的染色體異常核型率最低；根據流產次數分為3個亞組，3組染色體異常率均>40%，自然流產2次的異常核型比率最高為47.8%；根據流產孕周分為3個亞組，流產孕周<8周的染色體異常核型發生率為12.5%明顯低于其他2組。見表3。

表3 各因素與異常染色體核型發生率比較

3 討論

自然流產是一種妊娠期最常見的并發癥，且其患病率呈逐年上升的趨勢。染色體異常是自然流產的主要原因之一，研究認為自然流產的胚胎組織中染色體核型異常者約占50%[5]。絨毛細胞和胚胎組織均是由受精卵有絲分裂產生，攜帶的遺傳信息相同，因此可以作為標本檢查了解胚胎染色體的情況，查找自然流產的病因，為臨床診療工作提供依據。

本實驗中檢測絨毛染色體的方法采用的是絨毛染色體細胞培養G顯帶分析及高通量測序技術。絨毛染色體細胞培養G顯帶核型分析的方法是對中期分裂相進行數目或結構異常的判斷，可以準確檢出自然流產物或胎兒染色體結構和數目的異常，是檢測自然流產組織染色體核型異?；虍a前診斷的金標準。該方法技術穩定、質量可靠且費用低，提供了染色體改變的完整圖，在臨床應用較廣泛。然而，該技術也存在不足之處即耗時長，成功率直接受制于絨毛組織的新鮮程度和絨毛的形態，且難以檢出微小的染色體畸變(<5 Mb)。高通量測序，也稱為下一代測序技術，可以對數十萬到數百萬個DNA分子進行并行測序，最小可以檢測到10 kb的微小片段異常，并且其操作簡單，不需要耗時的細胞培養，分析周期短，特異性及分辨率高，覆蓋整個基因組。然而，缺點是成本高且不能發現染色體平衡易位、倒位、點突變及多倍體，因此不作為臨床實踐中的常規檢測方法，而作為常規染色體核型分析的補充檢測手段[6]。本研究中將192例自然流產患者的絨毛或胚胎組織，61例進行絨毛染色體G顯帶檢測，檢測成功率為24.6%。131例進行高通量測序檢測，檢測成功率達100%。絨毛染色體G顯帶的成功率明顯低于高通量測序檢測，二者之間差異有統計學意義(P<0.05)。絨毛染色體G顯帶檢測失敗的標本，可能由于胚胎停育時間長，組織不新鮮，形態差導致細胞未見分裂相，貼壁細胞生長，單細胞狀態差，絨毛組織已老化。因此，高通量測序測序檢測與絨毛染色體G顯帶檢測相比更有優越性，操作簡單，且檢測不易受細胞組織新鮮度的影響，臨床工作應用中二者可相結合。

胚胎染色體異常中以染色體數目異常最常見，多以染色體非整倍體為主[7]，其中16-三體綜合征和45,X最為常見，其次是2，13，15，18，21，22號染色體三體。本組資料中染色體異常核型率為44.5%，染色體數目異常約占染色體異常的89.2%，且以非整倍體為主，其中前幾位的非整倍體異常核型為16-三體約占20.0%，45,X約占15.4%，22-三體約占7.4%，2-三體約占7.4%，15-三體約占5.6%基本與既往的研究結果相符，常染色體三體是染色體異常的主要核型[8]。姐妹染色單體減數分裂不分離和過早分離，是導致胎兒非整倍體精子和卵子發生的主要機制[9]。16號染色體是亞端著絲粒染色體，22號、15號為端著絲粒染色體。著絲粒的位置與紡錘絲結合位點有關，可對姐妹染色單體的會聚與分離產生影響。端著絲粒染色體、亞端著絲粒染色體更易發生非整倍體。本組結果中21-三體核型為2例，發生率較低，由于此種核型的胎兒多可出生并長期生存，故在自然流產中發現的較少。此外有研究認為自然流產中最常見的16-三體、21-三體、22-三體綜合征是與孕婦年齡密切相關的，具體機制不詳，可能是由于隨著年齡的增長，卵泡刺激素水平升高，卵巢儲備功能下降，卵子老化，紡錘體聚合檢驗點蛋白的表達下降，導致紡錘體功能異常，當卵母細胞減數分裂時更易于形成非整倍體[10]。高齡孕婦體內的卵子在卵巢內儲存的時間較長，受到外界長期的危害，產生積累效應可致染色體畸變及基因突變，受精后更容易出現染色體數目及結構的異常。本組數據所得年齡≥40歲的染色體異常率最高，25～29歲染色體異常率最低，因例數較少，未行統計學分析。本組數據所得三倍體分別為69,XXY、69,XXX，研究發現約70%的胚胎染色體三倍體是母系起源的，相反，性染色體非整倍體異常更多是父系起源的(50%的47,XXY，100%的47,XYY和70%～80% 的45,X)[11]。

本組數據所得在異常核型中非整倍體發生率為84.6%，遠高于其他因素，表明非整倍體是導致自然流產的重要原因。然而，文獻報道染色體微結構的基因拷貝數變異是自然流產的重要原因[12]。本研究中共有7例存在染色體微缺失、微重復，約占異常核型的10.8%，其中微缺失占71.4.%，微重復占85.7%，微重復率明顯高于微缺失，提示染色體的微重復比微缺失可能更容易影響胚胎發育，導致自然流產。理論上人類染色體每個片段上都帶有一定的遺傳基因，如果存在缺失或重復，都有相對應的疾病，但是由于目前的技術水平限制，這些缺失及重復片段的致病性，目前沒有完全明確。在本研究中，6例病例中微缺失、微重復的片段均存在已知致病變異，且染色體的結構異常主要存在于4號及8號染色體的微缺失、微重復。據文獻報道，4號染色體的微缺失、微重復主要表現為骨骼、心血管等多發性畸形，且多伴有生長遲緩、智力低下、代謝紊亂，而畸形程度取決于缺失、重復片段的長度。8號染色體的微缺失、微重復主要表現為精神發育遲滯，顱面部、眼、心臟及骨骼的畸形，胎兒期多存在宮內發育遲緩及羊水過少等癥狀[13]。其余6、7、11、12、15號染色體上的微缺失及微重復基本上也集中表現在生長發育遲緩、多部位先天性畸形。

有文獻報道，流產發生的越早，胚胎染色體異常的發生率越高[14]。在不同的研究中，自然流產異常核型的發生率在妊娠12周之前為50%～60%[15]。這一比率根據孕婦的年齡而變化，孕婦年齡<35歲的約為35%，而孕婦年齡≥35歲的約為80%[16]。本組數據12周之前自然流產異常核型發生率為42.3%，略低于文獻報道，究其原因可能是研究對象的平均流產年齡為(29.40±4.18)周，低于35周歲。有研究報道，自然流產主要集中在8～12周，本研究中數據所得胚胎染色體異常發生在8～12周者占82.0%(50/61)，且流產孕周<8周的異常核型率最低，與既往的研究數據基本相符。

隨著流產次數的增加，胚胎染色體異常的可能性卻隨之降低，然而卻又報道認為，染色體異常率與流產次數無明顯相關性，可能與外界的物理、化學因素及生殖器官的畸形相關[17]。本組數據所得自然流產2次的異常核型率較其他組稍高，但由于本研究數據量較小，未能明確其相關性，仍需擴大樣本量明確兩者之間關系，提前評估再次妊娠的流產風險。

綜上所述，胚胎染色體異常是自然流產的主要原因，且以非整倍體異常為主，染色體的結構異常主要為4號染色體、8號染色體的微缺失、微重復。本研究通過對傳統的細胞遺傳學G顯帶、高通量測序技術對比研究，發現高通量測序技術檢測成功率明顯高于絨毛染色體G顯帶，且更適用于胚胎組織，更能快速、有效檢出染色體的微缺失、微重復，是對傳統的細胞遺傳學G顯帶的一個有效補充，可以明顯降低漏診率，但由于高通量測序技術價格昂貴，建議臨床醫生在工作中科學地選擇兩種檢測技術，合理結合有效指導臨床。