GLUT3在成人急性淋巴細胞白血病中的表達及意義

朱鴻燕 陽梅 何川

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一種起源于淋巴細胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，ALL是成人中最常見的急性白血病類型[1]。成人ALL治療方案較多并可緩解病情，但其復(fù)發(fā)率及其并發(fā)癥發(fā)生率較高且對化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，已嚴重影響患者生活質(zhì)量及其預(yù)后[2]。目前ALL發(fā)病機制尚未完全闡明，研究指出高血糖可導(dǎo)致脂代謝等多種代謝異常進而影響ALL患者預(yù)后生存時間[3]。故而相對穩(wěn)定的血糖水平對提高ALL患者治療效果及改善患者預(yù)后均具有重要意義。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucose transporter，GLUT)可促進細胞對葡萄糖的吸收，其中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-3(glucose transporter 3,GLUT3)在細胞攝取葡萄糖的過程中發(fā)揮重要作用[4]。研究表明GLUT3在子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤中均呈高表達，并可促進疾病進展，同時其與子宮內(nèi)膜癌等腫瘤細胞惡性程度及患者預(yù)后不良密切相關(guān)[5]。關(guān)于GLUT3在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的研究相對較少，因此，本研究通過檢測GLUT3在成人ALL患者中的表達并分析其與患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性，初步探討其在ALL發(fā)生及發(fā)展過程中的作用及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年2月至2016年3月在本院就診的成人初診ALL患者78例為ALL組，ALL患者均經(jīng)骨髓細胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫分型檢查及分子生物學(xué)等確診。ALL組中男40例，女38例；年齡25～55歲，平均(35.26±7.75)歲。根據(jù)免疫分型檢查、骨髓細胞學(xué)及分子生物學(xué)檢查結(jié)果將ALL患者分為B系A(chǔ)LL(B-ALL)49例，T系A(chǔ)LL(T-ALL)29例；Ph陽性患者15例，Ph陰性患者63例。同時選取40例非血液系統(tǒng)疾病患者為對照組，其中男23例，女17例；年齡19～60歲，平均(37.17±6.71)歲。2組受試者年齡、性別比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均知情且簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：所有ALL患者接受化療；年齡≥18歲；臨床資料完整者；ALL患者復(fù)查時接受骨髓評價療效者；對照組受試者均無急慢性感染或血液系統(tǒng)疾病。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤者；肝腎功能嚴重障礙者；合并自身免疫性疾病患者；合并其他系統(tǒng)嚴重疾病者；精神疾病患者。

1.3 方法

1.3.1 治療方案及其效果評估:成人ALL患者按照《中國成人急性淋巴細胞白血病診斷與治療專家共識》中的治療方案進行治療[6]，ALL患者均治療1個療程，治療結(jié)束后評價其治療效果，其中所有ALL患者初診前均未進行化療或ALL相關(guān)治療，1個療程治療后52例ALL患者完全緩解，26例ALL患者未完全緩解。

1.3.2 骨髓單個核細胞分離:無菌環(huán)境下分別抽取所有受試者骨髓5 ml，置于抗凝試管內(nèi)，按照等體積比將其加入Ficoll分離液(上海根生生物科技有限公司)，放入離心機內(nèi)離心，轉(zhuǎn)速為1 500 r/min，離心時間為15 min，將離心后試管中層內(nèi)單個核細胞吸出并調(diào)整細胞濃度為2×106ml，置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測骨髓單個核細胞中GLUT3基因表達水平:取出骨髓單個核細胞并加入細胞裂解液(上海通蔚生物有限公司)裂解，分別加入1 ml Invitrogen TRIzol試劑(美國Thermo Fisher公司)提取總RNA，利用紫外分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)檢測總RNA純度，以A260/A280≥1.80為合格RNA進行后續(xù)試驗，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為模板按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(日本Takara公司)進行qRT-PCR反應(yīng)。GLUT3基因引物序列：正向引物5’-GTGTCTCCCACTGCCCTAC-3’，方向引物5’-GCCCAGAATAAAGTCCAAA-3’；內(nèi)參基因GADPH引物序列：正向引物5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，反向引物5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。引物均由上海生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系：2×定量PCR Master Mix混合液10 μl，正反向引物(終濃度分別為0.08 μmol/L)各0.08 μl，cDNA模板2 μl，Taq DNA聚合酶 0.4 μl，ddH2O 7.44 μl。每個樣品均設(shè)置3個復(fù)孔。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，連續(xù)進行38次循環(huán)并分別擴增3次，GLUT3以GADPH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法分析骨髓單個核細胞中GLUT3基因相對表達量。

1.4 隨訪 通過查閱病例資料、復(fù)診及電話隨訪等方法對ALL患者進行隨訪，隨訪截止時間為2018年12月31日，統(tǒng)計ALL患者從初診至死亡或末次隨訪時間(總生存，OS)，并統(tǒng)計ALL患者治療后從完全緩解開始至首次白血病復(fù)發(fā)或死亡或末次隨訪時間(無病生存，DFS)。

2 結(jié)果

2.1 成人初診時ALL患者骨髓單個核細胞中GLUT3表達水平 ALL組患者骨髓單個核細胞中GLUT3表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，ALL不同分型B-ALL與T-ALL患者骨髓單個核細胞中GLUT3表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，B-ALL與T-ALL比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；ALL不同分型Ph陽性組與Ph陰性組患者骨髓單個核細胞中GLUT3表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，Ph陽性組與Ph陰性組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 成人初診時ALL患者骨髓單個核細胞中GLUT3表達水平

2.2 不同治療效果成人ALL患者骨髓單個核細胞中GLUT3表達水平 完全緩解組ALL患者骨髓單個核細胞中GLUT3表達水平顯著低于未完全緩解組(P<0.05)。見表2。

表2 不同治療效果成人ALL患者骨髓單個核細胞中GLUT3表達水平

2.3 GLUT3表達與成人初診時ALL患者臨床指標(biāo)的關(guān)系 根據(jù)成人初診時ALL患者骨髓單個核細胞中GLUT3表達水平平均值將其分為高表達組(48例)與低表達組(30例)，比較GLUT3表達與成人初診時ALL患者臨床指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果顯示GLUT3表達水平與ALL患者年齡、WBC數(shù)目、血紅蛋白、髓外侵犯明顯相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 GLUT3表達與成人初診時ALL患者臨床指標(biāo)的關(guān)系 例(%)

2.4 影響成人ALL患者預(yù)后的多因素分析 將單因素分析中對成人ALL患者OS與DFS有意義的因素納入COX回歸模型分析，結(jié)果顯示年齡、白血病髓外侵犯及GLUT3高表達是影響ALL患者OS與DFS的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響成人ALL患者預(yù)后的COX多因素分析

2.5 影響成人ALL患者預(yù)后的單因素分析 將影響成人ALL患者預(yù)后的相關(guān)因素進行單因素分析，結(jié)果顯示年齡、WBC數(shù)目、血紅蛋白、髓外侵犯及GLUT3表達均為影響成人ALL患者預(yù)后的危險因素(P<0.05)。見表5。

表5 影響成人ALL患者預(yù)后的單因素分析

3 討論

ALL患者體內(nèi)白血病細胞惡性增殖并浸潤骨髓及其他周圍組織器官進而抑制正常造血功能，目前臨床已有新型化療藥物治療ALL，但早期診斷與針對性治療ALL對改善患者預(yù)后具有重要意義[7]。因此，探尋ALL早期診斷及評估患者預(yù)后的新型指標(biāo)對提高治療效果具有重要應(yīng)用價值。

GLUT3在肺癌組織中呈高表達并可通過促進癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進而促進腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲，同時GLUT3高表達與乳腺癌惡性病變存在明顯相關(guān)性[8，9]。研究表明缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)可通過上調(diào)惡性腫瘤中GLUT3表達進而促進腫瘤發(fā)生及發(fā)展[10]。另有研究指出白血病患者脊髓缺氧微環(huán)境可促進白血病細胞增殖，缺氧環(huán)境下HIF-1表達水平升高并可促進白血病細胞分化及侵襲[11]。由此猜測成人ALL患者脊髓微環(huán)境處于缺氧狀態(tài)促使HIF-1表達水平升高并可通過上調(diào)GLUT3表達進而促進白血病細胞增殖及侵襲導(dǎo)致病情加重。本研究檢測成人ALL患者脊髓單個核細胞中GLUT3表達，結(jié)果顯示ALL組患者骨髓單個核細胞中GLUT3表達水平顯著高于對照組，其中B-ALL、T-ALL與Ph陽性組、Ph陰性組患者骨髓單個核細胞中GLUT3表達水平均顯著高于對照組，說明GLUT3在成人ALL患者脊髓單個核細胞中呈高表達并可能參與疾病發(fā)生過程，但GLUT3表達與ALL不同分型無關(guān)。提示成人ALL患者骨髓微環(huán)境可能處于缺氧狀態(tài)從而促使GLUT3表達水平升高導(dǎo)致疾病嚴重程度增加。同時成人ALL患者經(jīng)1個療程治療后分為完全緩解組與未完全緩解組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)完全緩解組ALL患者骨髓單個核細胞中GLUT3表達水平顯著低于未完全緩解組，提示GLUT3表達水平可能與成人ALL患者化療效果有關(guān)并可能促使化療耐藥性的發(fā)生。

年齡、WBC數(shù)目、血紅蛋白、是否發(fā)生髓外侵犯等均為ALL患者臨床指標(biāo)并與患者預(yù)后密切相關(guān)[12]。本研究根據(jù)成人ALL患者初診時GLUT3表達水平平均值將其分為高表達組與低表達組，分析其與ALL患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示隨著ALL患者年齡的增加、WBC數(shù)目增多、血紅蛋白含量增加及白血病細胞發(fā)生髓外侵犯GLUT3表達水平明顯升高，提示GLUT3可能參與成人ALL發(fā)展過程。同時GLUT3還與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲及遷移密切相關(guān)，并與腫瘤病理分期及患者預(yù)后有關(guān)[13，14]。研究指出ALL患者年齡越高其OS與DFS生存時間越低，WBC數(shù)目越高ALL患者OS與DFS越低，是否伴有白血病細胞髓外侵犯均可作為預(yù)測ALL患者預(yù)后的重要指標(biāo)[15]。本研究采用單因素分析法對影響成人ALL患者預(yù)后的相關(guān)因素進行分析，結(jié)果顯示年齡、WBC數(shù)目、血紅蛋白、髓外侵犯及GLUT3表達均為影響成人ALL患者預(yù)后的危險因素，進一步采用COX回歸模型進行多因素分析，結(jié)果顯示年齡、白血病髓外侵犯及GLUT3高表達是影響ALL患者OS與DFS的獨立危險因素，提示成人ALL患者骨髓單個細胞中GLUT3表達水平可作為評估患者預(yù)后潛在的重要指標(biāo)。

綜上所述，成人ALL患者骨髓單個細胞中GLUT3呈高表達并可參與該疾病發(fā)生及發(fā)展過程，其與ALL患者臨床指標(biāo)及化療耐藥密切相關(guān)，并可能作為評估成人ALL患者預(yù)后的重要指標(biāo)，可為成人ALL治療提供新型靶點。但GLUT3在成人ALL發(fā)生及發(fā)展過程中的具體作用機制有待深入研究。