高含量豬去氧膽酸精制工藝的研究

徐賓朋，郭慶，趙露，趙厚發

（安徽科寶生物工程有限公司，安徽 淮北 235025）

豬去氧膽酸（Hyodesoxycholic Acid，HDCA）是豬膽汁的主要成分，具有降血脂、鎮痙、祛痰作用，臨床上用于高血脂癥、氣管炎以及由肝膽疾病引起的消化不良，其作為清開靈注射劑中的有效成分，經臨床觀察對急性白血病的治療有良好作用，體外實驗證明其具有誘導細胞凋亡、抑制細胞的增殖分裂作用，也是人工牛黃的重要原料[1-2]，同時也是半合成鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸的原料。

豬去氧膽酸的精制有如下方法，重結晶法；將豬去氧膽酸采用乙酸乙酯進行2次重結晶，得到高含量的豬去氧膽酸，但產品的收率將會大大降低[3]。甲酯化法；將HDCA轉化為豬去氧膽酸甲酯-苯加成物后堿分解，調節pH、沉淀、得HDCA純品；鎂鹽法：將粗HDCA轉化為粗豬去氧膽酸鎂后，酸化、結晶，得HDCA純品，上述2種方法均需要將HDCA進行化學預處理，工藝步驟繁瑣，生產周期長，其中使用的苯為致癌物質[4-6]。針對現有的高含量豬去氧膽酸精制中存在的問題。

本研究采用正交設計優選出最佳除雜工藝條件且進行了驗證；對乙酯量、活性炭量及回流時間為考察因素對精制工藝進行正交實驗優化,并對優選的精制工藝進行驗證。

1 實驗部分

1.1 材料

豬去氧膽酸對照品購自中國食品藥品檢定研究院，豬去氧膽酸粗品購自四川某生物公司。

1.2 儀器及試劑

ZL-2000磁力攪拌加熱套、R1001N型旋轉蒸發儀購自鄭州長城科工貿有限公司；水浴鍋、SHZ-5B型真空泵電熱鼓風干燥箱購自鞏義市予華儀器有限公司；TP-2000電子天平購自福州華志科學儀器有限公司；8205A型筆試pH 計購自上海康儀儀器有限公司；SHT型攪拌數顯恒溫電熱套購自山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；Waters-1525型高效0液相色譜儀、Waters-2424型蒸發光散射檢測器(美國沃特世科技有限公司)。氫氧化鈉、濃鹽酸、冰醋酸、乙酸乙酯購自濱化集團股份有限公司，工業級。

2 方法

2.1 工業步驟

稱取豬去氧膽酸粗品，加水和氫氧化鈉，加熱至80℃，使其完全溶解，降溫至50℃，加入澄清劑，繼續加熱至90℃，保溫反應30 min，降至常溫，過濾，收集濾液，調pH 2～3，得濕品豬去氧膽酸；將濕品豬去氧膽酸稱重，加入乙酸乙酯，攪拌使其溶解后，加活性炭，加熱回流，趁熱精密過濾器過濾，濃縮乙酯層至出現白色顆粒狀結晶，停止濃縮，降溫冷卻結晶，離心的高含量豬去氧膽酸濕品，60℃干燥2 h，80℃干燥2 h，稱重得高含量豬去氧膽酸成品。

2.2 主要檢測指標

2.2.1 熔點的檢測方法

按照參考文獻[1]的方法進行檢測。

2.1.2 比旋度的檢測方法

按照參考文獻[1]的方法進行檢測。

2.1.3 醇溶度的檢測方法

按照參考文獻[1]的方法進行檢測。

2.1.4 殘渣的檢測方法

按照參考文獻[1]的方法進行檢測。

2.1.5 含量的檢測方法

測定粗品和精品豬去氧膽酸的含量,依據參考文獻采用高效液相色譜法，采用C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇∶乙腈∶冰醋酸(0.5%，質量分數)溶液(49∶20∶31)為流動相，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為25℃，蒸發光散射檢測器，漂移管溫度為108℃，載氣流速為2.8 L·min-1。

3 結果與分析

3.1 豬去氧膽酸除雜工藝的優化

3.1.1 制定因素水平表根據文獻[8]及預實驗結果,考察的因素及其范圍確定如下:水用量的倍數、pH、澄清劑的量,選L9(34)的正交設計進行實驗,每個因素設計3個水平,因素水平見表1。

表1 除雜工藝因素水平表

3.1.2 試驗方法

稱取CK191202批次豬去氧膽酸粗品100 g，按設計條件加水溶解，調pH溶解后，60℃加入澄清劑，85℃保溫反應30 min，降至常溫過濾，濾液用稀鹽酸酸化至pH4.0，豬去氧膽酸析出，離心，干燥得豬去氧膽酸，按2.2法檢測主要指標。

3.1.3 除雜工藝正交實驗結果及統計分析

經SPSS18.0統計分析的結果見表2、表3。

方差分析因素的主次關系為A＞B＞C,其中A2＞A3＞A1,B1＞B2＞B3,C2＞C3＞C1,最佳的方案為A2B2C3。方差分析結果表明：A因素的影響具有顯著意義(P＜0.05),B、C因素對收率的影響均不顯著(P＞0.05)。

3.1.4 驗證實驗

從表2和表3實驗結果看，最佳方案為A2B2C3，為驗證上述工藝的正確性，做A2B2C3工藝驗證試驗。

表2 除雜工藝正交實驗結果

表3 除雜工藝方差分析表

用不同批次的5批豬去氧膽酸粗品各稱取100 g，按工藝A2B2C3做驗證試驗，測得豬去氧膽酸粗品得量和含量，計算收率,得出不同批次不同含量的原料，通過優化的除雜工藝，收率和醇溶度均合格，說明除雜工藝的最佳工藝條件為A2B2C3，即10倍量的水，pH 11.5,質量分數為1.5%的澄清劑，可以滿足不同的原料的除雜。驗證結果見表4。

表4 不同批次的驗證實驗結果

3.2 豬去氧膽酸精制工藝的優化

3.2.1 粗品制備

稱取CK191210批豬去氧膽酸2 kg，加20 kg的水，調pH 11.5，加熱至60℃，加30 g澄清劑（溶于質量分數為1%的冰醋酸），保溫反應30 min，降溫至常溫，過濾，濾液用稀鹽酸酸化至pH 4,抽濾，干燥得豬去氧膽酸粗品1 632 g,得率81.6%,質量分數為95.5%，收率97.4%。

3.2.2 制備因素水平表

根據文獻[8]及預實驗結果,考察的因素及其范圍確定如下:乙酸乙酯量、活性炭用量和回流時間，選L9(34)的正交設計進行實驗,每個因素設計3個水平,因素水平見表5。

表5 精制工藝正交因素水平表

3.2.3 精制工藝

稱取豬去氧膽酸粗品100 g，分別按照L9(34)表中設計的條件進行精制，加乙酸乙酯，活性炭，加熱回流，精密過濾器去除活性炭，濾液濃縮至出現白色顆粒結晶時，停止濃縮，取出降溫冷卻結晶，抽濾結晶，濾液再次濃縮結晶，合并結晶，干燥，取樣檢測豬去氧膽酸的含量和殘渣。

3.2.4 精制工藝正交實驗結果及統計分析

計算結果及方差分析結果見表6和表7。

表6 精制工藝正交的試驗結果

表7 精制的方差分析表

從表6和表7中可以看出，三種因素的影響程度依次為：A＞B＞C。其中A3＞A2＞A1,B2＞B3＞B1,C1＞C2＞C3，A因素的影響具有顯著的意義(P＜0.05)，B、C因素對收率的影響均不顯著(P＞0.05)。最佳的精制工藝條件為A3B2C1，即12倍量的乙酸乙酯、質量分數為3%的活性炭，加熱回流1 h。

3.2.5 工藝驗證

選擇除雜工藝中的相對應的5批粗品，進行工藝驗證，按照最佳工藝條件即12倍量的乙酸乙酯、3%的活性炭，加熱回流1 h。結果與正交實驗中收率最高的序列8吻合，說明了該最佳工藝條件，針對不同含量的粗品均可達到高含量和高收率，從而證明該最佳精制工藝的穩定性和合理性。結果見表8。

表8 精制最佳工藝的驗證結果

4 結 論

最佳除雜工藝為水量是10倍量、pH 11～12，澄清劑質量分數為1.5%；最佳的精制為工藝乙酸乙酯用量為12倍量、活性炭的用量為3%，回流時間1 h。

通過實驗本精制工藝對原料的選擇，控制在低含量的豬去氧膽酸的質量分數不低于75%且殘渣不大于1%，為高含量豬去氧膽酸精制的最低標準。一般粉末的活性炭不能滿足吸附脫色的效果，必選選擇醫用767的活性炭，且使用前需105℃活化4 h。