351株甲真菌病病原菌臨床分布及體外藥敏試驗

鄭文愛，喬 鳳，唐小正，吳偉偉

(海南省第五人民醫院 1. 檢驗科；2. 皮膚科，海南 海口 570206)

甲癬通常指皮膚癬菌感染指甲或趾甲所引起的疾病。甲真菌病是一個用于描述甲真菌感染性疾病的非特定術語，除了皮膚癬菌感染外，還可由一部分的霉菌和假絲酵母菌感染引起。甲真菌病影響美觀，病情嚴重可以影響生活質量。強效、安全的口服及外用抗真菌藥物的問世，給甲真菌病的治療帶來了顯著的效果。甲真菌病的臨床診療仍缺乏統一的診斷標準和治療原則，存在診斷不清、盲目選擇口服藥物等問題，導致治療效果不理想。故本研究收集海南省各地區甲真菌病患者的甲屑標本，對培養出的真菌菌株進行分析和體外藥敏試驗，以便了解海南省2016—2018年甲真菌病病原菌的分布以及菌株對臨床常用抗真菌藥物的敏感性，為臨床的診療提供相關依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共收集2016年5月—2018年11月某院就診的具有典型甲真菌病臨床表現及真菌直接鏡檢陽性的患者348例，其中男性138例，女性210例；年齡為1～82歲，平均年齡為(33.91±6.03)歲；病程1個月～15年，平均病程為(4.24±3.20)年。

1.2 材料與方法

1.2.1 材料 主要材料包括含氯霉素(50 mg/L)的沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA，江門凱創公司生產)、馬鈴薯培養基(PDA，自配)[1]、尿素培養基(自配)[1]、酵母菌(YST)鑒定卡(法國梅里埃公司生產)、科瑪嘉顯色培養基(SAP，迪景公司生產)，主要儀器包括生物顯微鏡(型號:CX21，OLYMPUS公司生產)、生物安全柜(型號: BSC-1300IIA2，北京聯合科儀科技有限公司生產)、電恒溫培養箱(型號: YS-138C，福意聯公司生產)。

1.2.2 方法

1.2.2.1 取材 75%乙醇消毒病甲及周圍皮膚，用滅菌手術刀輕輕刮取病甲屑置于滅菌玻片上。將取得的甲屑均分為二，一份加10%KOH(氫氧化鉀)后蓋上蓋玻片鏡檢，一份用于真菌培養。

1.2.2.2 真菌培養 采用三點接種法將樣本接種在兩管SDA中，置入25～28℃電恒溫培養箱中，培養2～4周，每隔3 d觀察1次，如每管斜面培養基中2個點或3個點有同1種真菌生長即鑒定為病原菌。

1.2.2.3 菌種鑒定 根據菌落生長速度快慢、菌落的形態特征和顏色變化進行鑒定，盡量鑒定到種。若生長出絲狀毛癬菌落即可接種到尿素培養基和PDA，觀察菌落形態、大小、顏色變化進行初步鑒定；同時做銅圈法小培養，在顯微鏡下觀察小培養生長情況，根據鏡下大、小分生孢子形態結構特點，判斷毛癬菌種類。生長出酵母菌落即可接種到SAP觀察顏色變化，同時分離轉種菌落，取單個菌落上鑒定卡鑒定菌種。白假絲酵母菌鑒定必要時加做血清芽管試驗。疑難的菌種轉種PDA，培養7 d后，送公司進行測序。

1.2.2.4 藥敏試驗 甄選98株經測序后的菌株進行藥敏試驗，其中絲狀真菌44株，包括紅色毛癬菌23株、指(趾)間毛癬菌5株、茄病鐮刀菌12株、威尼克何德霉4株，假絲酵母菌54株，包括白假絲酵母菌16株、近平滑假絲酵母菌21株、熱帶假絲酵母菌13株、都柏林假絲酵母菌4株。藥物選用本地區常用抗絲狀真菌藥物(特比萘芬、伊曲康唑、伏立康唑和氟康唑)和抗假絲酵母菌藥物(伊曲康唑、伏立康唑、氟康唑和酮康唑)。藥敏試驗方法采用液基稀釋法，最小抑菌濃度(MIC)值采用點判讀法進行結果判讀。特比萘芬MIC判讀標準為與生長對照相比較，無任何肉眼可辨生長(100%)的最低藥物濃度；唑類藥物(伊曲康唑、伏立康唑、氟康唑和酮康唑)MIC判讀標準為與生長對照進行比較，生長明顯抑制(80%)的最低藥物濃度。同時重復檢測2孔，2孔結果必須一致才能判為MIC值。對所有試驗菌株記錄藥物MIC值，計算MIC范圍、MIC幾何均數；質控標準株為近平滑假絲酵母菌(ATCC22019)。具體操作參考美國臨床實驗室標準化協會2008年版絲狀菌藥敏試驗方案M38-A2(CLSI-M38-A2)[2]和美國臨床實驗室標準化協會2008年版酵母菌藥敏試驗方案M27-A3(CLSI-M27-A3)[3]進行。

2 結果

2.1 一般情況 共收集348例甲真菌病患者，其中345例患者分離出單一的病原菌，3例患者分離兩種病原菌，共分離351株病原菌，其中1例患者分離紅色毛癬菌和光滑假絲酵母菌，1例患者分離熱帶假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌，1例患者分離茄病鐮刀菌和近平滑假絲酵母菌。348例患者來自海南省各個市縣，其中以北部地區(海口市、澄邁縣)居多，共305例；其次是南部地區(三亞市、樂東縣、東方市、三沙市)16例，中部地區(瓊中縣、五指山市、屯昌市)11例，西部地區(儋州市、臨高縣、昌江市、白沙縣)10例，東部地區(文昌市、瓊海市、萬寧市、陵水市)6例。

2.2 病原菌的構成 351株病原菌以酵母樣菌屬為主(53.28%)，其中優勢菌為近平滑假絲酵母菌(22.22%)和白假絲酵母菌(11.40%)；其次是皮膚癬菌屬(29.63%)，其中優勢菌為紅色毛癬菌(25.07%)。女性與男性患者分別檢出病原菌216、135株。見表1。

表1 不同性別甲真菌病患者分離真菌分布

2.3 各年齡段患兒病原菌的分布 檢出病原菌的患者年齡段主要集中在21～30歲(86株)、31～40歲(77株)、41～50歲(49株)。見表2。

表2 各年齡段不同性別甲真菌病患者病原真菌分布情況(株)

2.4 臨床分型 甲真菌病患者臨床分型主要為以遠端側緣甲下型(47.41%)、淺表白甲型(18.97%)、全甲破壞型(15.80%)為主。348例甲真菌病中有181例來自于指甲，167例來自于趾甲，指甲與趾甲比是1∶1.08。見表3。

表3 不同性別的甲真菌病患者臨床分型分布(例)

2.5 藥敏結果 紅色毛癬菌和指(趾)間毛癬菌對特比萘芬的MIC幾何均數最低(分別為0.008、0.010 μg/mL)，茄病鐮刀菌對伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑的MIC幾何均數均較高(分別為3.793、11.016、57.018 μg/mL)，對伏立康唑MIC幾何均數最低(1.260 μg/mL)；假絲酵母菌(白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、都柏林假絲酵母菌)對酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑的MIC幾何均數均較低。見表4。

表4 常見抗真菌藥對甲真菌病病原真菌的MIC值(μg/mL)

3 討論

甲真菌病是成人最常見的甲病，占所有甲疾病的15%～40%。據統計英國成人甲真菌病發病率為3%，約1/3 的甲癬患者與足癬相關，且老年人和男性最容易發生甲真菌感染[4]。甲真菌病的病因有較廣泛的地域和種族差異，在英國85%～90%的甲真菌感染是由皮膚癬菌引起，5%由非皮膚癬菌性霉菌引起，最常見的病原菌是紅色毛癬菌和趾間毛癬菌，親動物性皮膚癬菌通常僅見于指甲感染中。甲癬易感性有其遺傳學基礎，家族性遠端側緣甲真菌病由紅色毛癬菌感染引起，與家庭內部間傳染無關[4]。

本研究中甲真菌病患者男女比例為1∶1.52，女性多于男性，尤其集中在21～30歲、31～40歲這兩個年齡段的中青年女性，與大多數中文文獻[4-7]報道的發病年齡相符；考慮原因可能為女性更注重儀表，穿著高跟鞋及做美甲等行為容易造成指/趾甲物理及化學性損傷，以及患病后求治心理更為迫切；且此年齡段的女性是家務勞動的主要人群，考慮在做家務時，存在可能長時間穿著不透氣防水鞋等因素。348例甲真菌病臨床分型以DLSO型最常見(占47.41%)，與國內相關文獻[5-7]報道一致，可能是由于甲的生理結構使其前端和側緣容易受傷，或是遠端和側緣易受到鞋子的擠壓從而引起損傷。 患甲中的指甲與趾甲比是1∶1.08，與本地報道[8]結果一致，可能與本地天氣潮濕炎熱、長期穿鞋襪、透氣性差等原因相關，導致趾甲易被真菌感染。

本研究中病原菌是以近平滑假絲酵母菌為優勢菌的酵母菌屬為主，與相關文獻[8-9]報道結果一致，不同于文獻[5-7，10-18]報道甲真菌病的首要病原菌為皮膚癬菌屬，可能與不同的地域、氣候環境、人群等因素相關。本研究結果顯示甲真菌病患者中近平滑假絲酵母菌(22.22%)比白假絲酵母菌(11.40%)所占比率高，而熱帶假絲酵母菌(6.27%)和光滑假絲酵母菌(1.71%)構成比較低，此結果與筆者以往研究[8]結果相同，但與國內幾次大規模的甲真菌病病原菌流行病學的多中心研究報道[10-13]和近年來專家們相關報道[7，14-18]結果不一致。說明海南地區引起甲真菌病的主要酵母菌屬不再是以往認為的白假絲酵母菌，可能會隨著時間、地點的不同而發生改變。本研究顯示共分離毛孢子菌(阿薩希毛孢子菌、黏性絲孢酵母菌)25株(占7.12%)，但筆者以往的研究[8]中未發現有毛孢子菌，原因可能是與本次研究方法中部分形態學不能準確鑒定的菌株，均采用分子測序方法，能準確鑒定病原菌。本研究分離的病原菌其次為皮膚癬菌屬，只分離出紅色毛癬菌(25.07%)和指(趾)間毛癬菌(4.56%)，未分離出其他皮膚癬菌，主要致病皮膚癬菌種類與全國各地的報道[5-18]基本相同。霉菌屬中主要檢出黃曲霉和煙曲霉，與相關報道[5-15]結果基本相同。

本研究中分離出威尼克何德霉(1.14%)、對半新柱頂孢(0.86%)、橄欖小孢似盤多毛孢(0.28%)、木霉(0.28%)等熱帶和亞熱帶自然環境中存在的菌株，其中威尼克何德霉是熱帶、亞熱帶多見的掌黑癬病原菌，除了對半新柱頂孢在國內外分離的病甲中已有相關報道[12-13]外，其余真菌目前國內外未有分離自甲真菌病的報道。因此除皮膚癬菌屬外，酵母菌屬、霉菌屬和其他絲狀真菌三種分類的菌株也可能為污染菌或定植菌，臨床醫生在診治時應充分結合臨床癥狀、病史和地域特殊性因素進行分析。本次研究發現了3例患者分離出兩種病原菌，提示臨床醫生在診療過程中應注意多重真菌感染。

分析98株真菌菌株的藥敏試驗，氟康唑對部分紅色毛癬菌MIC值較高，說明該藥物可能不是紅色毛癬菌的最佳選擇,此結果與相關研究[18-19]結果相似。本地區皮膚癬菌引起的甲真菌病推薦首選特比萘芬、伊曲康唑，與英國以及中國甲真菌病診療指南[4，20]推薦方案一致。茄病鐮刀菌對伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑的MIC值較高，對伏立康唑的MIC值相對較低，說明可能前3種藥物不適用于茄病鐮刀菌引起的甲真菌病單物治療，可考慮藥物聯合治療方案。假絲酵母菌引起的甲真菌病可首選伏立康唑、酮康唑、伊曲康唑，尤其要注意克柔假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌對氟康唑天然不敏感。

由于甲真菌病患者直接鏡檢和真菌培養的陽性率均不高，且培養與藥敏試驗耗時較長，難以滿足臨床的實際需要。因此，臨床工作中很多皮膚科醫生在真菌培養和藥敏試驗結果出來之前即憑經驗用藥。了解海南地區近兩年甲真菌病的臨床分型、病原菌的分布情況，以及分離到的主要菌株藥敏結果，對本地區甲真菌病的臨床診治具有重要的指導意義。