不同人群新型冠狀病毒核酸檢測的臨床價值

胡亞會，鄭 陽，李瑩瑩，陳 軍，孟婧潔，閆 琛，宋銀森

(鄭州人民醫院轉化醫學研究中心，河南 鄭州 450015)

2019年12月以來，我國湖北省武漢市發現一種以發熱、肺部感染為主要癥狀的傳染性疾病，隨后在全國各省市地區發現類似疾病。2020年1月7日，中國疾病預防控制中心從患者的咽拭子標本中鑒定出一種新型冠狀病毒，最初被世界衛生組織(WHO)命名為2019-nCoV[1-3]。1月30日，世界衛生組織(WHO)宣布新型冠狀病毒肺炎疫情構成國際關注的突發公共衛生事件[4]。2月11日，WHO將這種疾病重命名為2019冠狀病毒病(COVID-19)，引起該疾病的病毒為新病原體，重新命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)。目前，COVID-19呈現出全球范圍內流行趨勢，截至4月1日10時，我國確診病例82 617例，境外輸入病例771例；除我國以外，全球已有200個國家和地區774 494例確診病例[5]。

SARS-CoV-2為β屬冠狀病毒，是單股正鏈RNA病毒，在此之前流行的人冠狀病毒主要有6種，分別為α-冠狀病毒的HCoV-229E和HCoV-NL63，β-冠狀病毒的HCoVOC43、HCoV-HKU1、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)。其中，SARS-CoV、MERS-CoV和 SARS-CoV-2均表現為嚴重的下呼吸道感染[6]。SARS-CoV-2可通過飛沫、接觸和氣溶膠傳播，與2003年流行的SARS-CoV相比，SARS-CoV-2致死率相對要低(4%)，但隱性感染者和輕癥病例較多，使得傳播更為廣泛[7-8]。實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測呼吸道標本SARS-CoV-2核酸檢測和高通量測序發現SARS-CoV-2基因均為確診COVID-19的金標準。但是，高通量測序耗時長、成本高、對檢測人員和儀器要求高，不能滿足大規模標本檢測的臨床需求。RT-PCR病毒核酸檢測具有簡便快速、特異性高、成本較低、易于操作等優點，可以廣泛應用于臨床[9]。本文采用RT-PCR方法對發熱門診、隔離病區患者、本院一線疫情防控醫護人員、未出現COVID-19癥狀的住院患者、陪護家屬和大范圍篩查復工前體檢人群進行檢測，為臨床SARS-CoV-2核酸檢測提供實驗室參考。

1 對象與方法

1.1 標本來源 收集2020年2月1日—3月22日鄭州人民醫院(河南省鄭州市COVID-19定點檢測和收治醫院)發熱門診、隔離病房疑似和確診COVID-19患者(共2 685例)的咽拭子標本，同時采集本院疫情防控一線醫護人員、所有未出現COVID-19癥狀的住院患者、陪護家屬和復工體檢人員的咽拭子標本。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑與儀器 采用兩種試劑盒對發熱門診和隔離病房檢出的所有陽性標本和確診COVID-19患者治療后復查標本進行檢測，分為A組和B組，其余送檢標本只用其中一種檢測試劑盒。A組采用上海之江生物新型冠狀病毒核酸快速檢測試劑盒(RT-PCR)，病毒RNA提取采用EX3600核酸提取儀(上海之江生物)。B組采用湖南圣湘生物新型冠狀病毒核酸快速檢測試劑盒，不需提取病毒RNA直接按照說明書配制反應體系并擴增產物。兩組均采用美國Thermo Fisher Scientific ABI7500型熒光定量PCR儀對PCR產物進行擴增。

1.2.2 檢測方法 所有標本先56℃滅活30 min預處理后再進行RT-PCR檢測。A組需提取病毒RNA，嚴格按照之江試劑說明書進行提取，標本混勻后，吸取300 μL標本(咽拭子病毒保存液或血清標本)采用磁珠法獲得50 μL的病毒總RNA溶液。按照兩種廠家試劑說明書設置反應程序，A組檢測SARS-CoV-2開放讀碼框1ab(open reading frame, ORF1ab)、核殼蛋白(nucleoprotein, N)基因和包膜蛋白(envelope protein, E)基因三個位點，B組檢測SARS-CoV-2 ORF1ab基因、N基因兩個位點。

1.2.3 結果判讀 兩組檢測試劑均含內源性監測系統(內標，IC)，用于監控核酸提取及擴增過程，每次試驗均設置陰性和陽性對照。結果分析時首先查看內標通道是否有擴增曲線，擴增產物的熒光信號是否達到設定的熒光閾值時所對應的擴增循環數(cycle threshold，Ct)，同時檢查質控品結果是否合格。以上要求均滿足說明試驗有效，如果有一條不滿足則為無效需重新檢測。A試劑PCR產物擴增結果判定為陽性(Ct值≤43，典型S擴增曲線)，陰性(Ct值>43或無擴增曲線)；B試劑PCR產物擴增結果判定為陽性(Ct值≤40，典型S擴增曲線)，陰性(Ct值>40或無擴增曲線)。

1.3 統計學分析 應用SPSS 20.0統計軟件對所有數據進行分析，計數資料采用例數或百分比表示，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 易感人群及大范圍篩查結果 共檢測本院一線疫情防控醫護人員、所有未出現COVID-19癥狀的住院患者、陪護家屬和復工體檢人員咽拭子標本12 812份，所有標本SARS-CoV-2核酸檢測均為陰性。見表1。

表1 易感人群及大范圍篩查人員咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測結果(份)

2.2 發熱門診患者和隔離病房患者核酸檢測結果 共檢測發熱門診、隔離病房患者2 685份咽拭子標本，其中核酸陽性24份(0.89%)，陰性2 661份(99.11%)；24例咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性患者同時送檢的血標本，SARS-CoV-2核酸檢測結果呈陰性。咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性患者中年齡12～86歲，中位數為47歲；男性患者13例(54.17%)，女性患者11例(45.83%)。見表2。

表2 發熱門診、隔離病房患者咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測結果[例(%)]

2.3 兩組試劑盒首次核酸檢測陽性結果 24例SARS-CoV-2核酸陽性咽拭子標本，兩組試劑首次核酸檢測均為陽性。A組試劑病毒 ORF1ab基因、N基因和E基因三個位點均呈典型S擴增曲線，B組試劑病毒 ORF1ab基因無擴增曲線、N基因呈典型S擴增曲線。見圖1。

A為之江試劑，B為圣湘試劑。

2.4 兩組試劑復查核酸檢測結果 24例確診COVID-19患者治療后復查SARS-CoV-2核酸時，2例患者咽拭子標本A組試劑檢測結果均為陽性，且SARS-CoV-2 ORF1ab基因、N基因和E基因三個位點均呈S擴增曲線，B組試劑檢測結果均為陰性(見圖2、3)；其余22例患者咽拭子標本兩組試劑檢測結果一致。

A為之江試劑，B為圣湘試劑。

A為之江試劑，B為圣湘試劑。

3 討論

根據SARS-CoV-2核酸檢測專家共識要求，SARS-CoV-2核酸檢測應在經過嚴格生物安全評估的二級生物安全實驗室進行，檢測人員均執行三級生物安全防護[10]。采集咽拭子方法為在咽峽深部(懸雍垂及扁桃體兩側)利用植絨拭子反復刮取，采集后立即將拭子頭浸入含3 mL的病毒保存液管[11]。實時熒光定量RT-PCR檢測SARS-CoV-2核酸很少出現徦陽性，但是陽性患者的陽性率相對較低(30%～50%)，所以疑似病例需經過多次核酸檢測提高陽性率。本研究結果顯示，發熱門診、隔離病房患者SARS-CoV-2核酸陽性率為0.89%，與海南三亞某醫院的陽性率相當[12]。核酸檢測結果容易出現假陰性，除了試劑影響因素外，可能還與病毒本身的變異、采集樣本時間、標本質量、檢測人員操作水平、儀器設備等因素有關[13]。

實時熒光定量RT-PCR技術的特異性和敏感性均較高，可用于各種類型生物標本的檢測，如痰、呼吸道分泌物、血、尿和糞便等，對疾病早期診斷和治療效果監測具有重要的臨床指導價值，尤其對于無癥狀感染者的早期發現更為重要[14]。對所有本院一線疫情防控醫護人員、未出現COVID-19癥狀的住院患者、陪護家屬等易感人群進行篩查，可以防范醫患、陪護和探視人員之間的交叉感染，有利于全院疫情防控工作的順利進行[15]。目前，全國范圍工業企業平均復工率約為98.6%，復工人員進行SARS-CoV-2核酸篩查，可大幅度縮短醫學觀察時間，保障復工復產過程中的疫情防控需要。

本研究SARS-CoV-2核酸陽性標本均來自于咽拭子，24例咽拭子檢測核酸陽性患者，其同時送檢的血標本SARS-CoV-2核酸檢測均為陰性，與施紹瑞等[16]研究結果一致。可能原因為：(1)所有確診病例均為輕型和普通型，未發現重型/危重型病例，不能代表所有類型確診患者的檢測結果；(2)納入的確診患者病例數相對較少，樣本量有限。本研究24例確診COVID-19患者男女性別比為1.18∶1，對全國72 314例確診COVID-19病例研究發現男女比例為1.06∶1[17]，上海市某三甲醫院14例COVID-19確診患者的男女比例為1.33∶1[18]，基于以上數據推測可能樣本量越大男女比例越接近1∶1。本研究發現，確診COVID-19患者年齡中位數為47歲，62.50%的患者年齡集中在20～60歲，與相關文獻[12,17-18]研究結果雖有所差異，但均提示年齡與COVID-19的感染相關，中老年人群更易感染。

目前，國家藥品監督管理局(NMPA)批準的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒中大多數采用實時熒光定量RT-PCR，且均采用Taqman探針[19]。本研究比較了兩種國產試劑盒核酸檢測結果，發現兩種試劑對陽性咽拭子標本核酸檢測能力差別不大，但A試劑檢測病毒ORF1ab、N和E三個基因位點，B試劑只能檢出病毒N基因位點。對COVID-19患者治療后復查SARS-CoV-2核酸結果Ct值接近陽性臨界值的咽拭子標本，A試劑的檢測能力要優于B試劑。分析原因可能是：(1)由于此次疫情屬于突發公共衛生事件，試劑盒在研發過程中尚無足夠的臨床標本和時間進行完整的性能驗證，尤其是對于檢出限和灰區的臨床驗證，各廠家核酸檢測試劑盒質量的穩定性和可靠性需要不斷優化；(2)由于本研究納入的確診患者病例數較少，樣本量有限，并不能代表2種試劑的整體檢測性能[20]。

此外，本研究發現與首檢咽拭子標本的Ct值相比，24例確診COVID-19患者經治療后復檢咽拭子樣本的Ct值，大多數有所下降，表明隨著臨床癥狀的緩解，病毒載量在患者體內亦有所下降。當臨床癥狀完全消失，連續兩次復檢咽拭子SARS-CoV-2核酸陰性，可作為臨床治愈出院標準。目前，在本院治療的24例確診COVID-19患者中，初診均為輕型和普通型；其中23例從入院開始病情逐漸好轉直至治愈出院，1例初診輕型患者治療1周后病情加重轉為重型，改變方案繼續進一步治療后治愈出院。后續將持續進行出院患者的追蹤隨訪，健康指標監測，以便進一步認識COVID-19。

本研究對發熱門診和隔離病房患者、易感人群以及大規模篩查人群進行SARS-CoV-2核酸檢測，發現SARS-CoV-2核酸檢測對于COVID-19患者的臨床診療和控制疫情進展有非常重要的價值。分析兩個部位生物標本的核酸檢出陽性率和兩種不同廠家試劑的檢測能力，為SARS-CoV-2實驗室核酸檢測提供參考依據。本研究的局限性在于未對24例確診COVID-19病例做臨床和流行病學特征分析，不能為制定疫情防控策略和措施提供科學依據，下一步將重點分析確診COVID-19病例的臨床和流行病學特征。