復合酶酶解乳清制備抗氧化肽的工藝優化及應用

沈荷玉，蔣瑩，唐婉婷，姜榮杰，周可強，李辰鳳，李誠

（四川農業大學食品學院，四川雅安625000）

0 引言

乳清是生產干酪的副產物，約含0.6%的乳清蛋白，這部分乳清蛋白還沒有被大量開發利用[1-2]。工業化生產干酪會排放出大量的乳清，因此乳清資源豐富[3-4]。我國已將乳清作為原料研制各種乳清飲料[5-6]，且酶法水解的乳清飲料，感官性質良好[7]。

乳清多肽有抗高血壓、抗氧化等多種功能，還可以改善乳清蛋白的加工性能，而近年來乳清功能性多肽的研究也已成為熱點[8-10]。本研究以鮮牛乳為原料，采用復合酶（中性蛋白酶和木瓜蛋白酶）一步法酶解乳清制備抗氧化肽，以羥自由基清除率為指標，優化酶解工藝條件，并將在最佳酶解條件下制得乳清酶解液和其他配料一起調配成桑葚枸杞乳清多肽復合飲料，為乳清功能飲料的生產加工提供一定的實驗和理論基礎。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

鮮牛乳（四川農業大學農場生產）、水（GB/T6682規定的三級水）、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、氫氧化鈉、對硝基苯酚、乙酸鈉、無水乙酸鈉、乙酸、37%甲醇、乙酰丙酮、鹽酸、中性蛋白酶（50 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、乙醇、乙酸、磷酸、硫酸鐵銨（均為分析純）。

1.1.2 儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海力辰邦西儀器科技有限公司；Phs-3C+酸度計，方舟科技；JA12038電子天平，上海越平科學儀器有限公司；Varioskan las熒光酶標儀，美國Thermo；Thermo Sorvall ST 16 ST16R通用臺式離心機，賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 乳清制備

（1）巴氏殺菌：鮮牛乳76℃殺菌20 s，放入冰水降溫。

（2）脫脂：取50 mL離心管裝入樣品，轉速8 000 r/min，4℃離心20 min。將下層清液（脫脂乳）沿管壁緩慢倒入燒杯，底部沉淀丟棄。

（3）制備乳清：使用磁力攪拌器（低速攪拌）和p H計，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH滴定至pH值為4.6，靜置30 min，用四層紗布過濾備用。

1.2.2 復合酶一步水解乳清的單因素實驗

選擇不同酶解溫度（47.5，50，52.5，55，57.5℃），不同酶解pH值（6，6.5，7，7.5，8），不同酶量比例（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1）3個因素進行單因素試驗，實驗結果以羥自由基清除率為評價標準來確定合適的酶解條件范圍，以便進行后續響應面優化實驗。

1.2.3 復合酶一步水解乳清的響應面優化實驗

在單因素實驗的基礎上，以水解溫度、pH值、酶比（中性蛋白酶：木瓜蛋白酶）3個因素為自變量，以乳清多肽的羥自由基清除率為響應值，設計3因素3水平響應面分析實驗，以Design-Expert8.0.6軟件對實驗進行回歸分析[11]，響應面實驗因素和水平如表1所示。

1.2.4 桑葚枸杞乳清多肽復合飲料配制

（1）制備乳清。

（2）將制得乳清在羥自由基清除率最高的條件下水解得乳清水解液。

（3）枸杞子→挑選→清洗→除雜去梗→粉碎過篩（40目）→取枸杞粉→煮沸的乳清水解液浸泡30 min→四層紗布200目篩子過濾→取清液備用。

（4）桑葚干→挑選→清洗→除雜去梗→粉碎過篩（40目）→取桑葚粉→煮沸乳清水解液（用浸泡過枸杞過濾后的乳清水解液）浸泡30 min→四層紗布200目篩子過濾→取清液備用。

（5）取浸泡過枸杞粉和桑葚粉的乳清水解液→加入蜂蜜→加入檸檬酸→調配→均質（20 MPa）→殺菌（121℃，5 min）→灌裝（100 mL玻璃瓶）→二次殺菌（121℃，1 min）→冷卻→成品。

工藝流程為：

1.2.5 桑葚枸杞乳清多肽復合飲料配方的正交實驗

考慮到乳清多肽飲料產品配方的交互影響，以桑葚（A）、枸杞（B）、檸檬酸（C）、蜂蜜（D）為因素，設計三因素三水平正交實驗，以感官評定作為指標，確定桑葚枸杞乳清多肽復合飲料的最適配方。

1.3 指標測定方法

1.3.1 蛋白質含量的測定

參照國標GB/T 5009.5-2016[12]。

1.3.2 羥自由基清除率的測定

在試管中加入0.5 mL濃度10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、0.5 mL樣液、0.5 mL濃度10 mmol/L的FeSO4溶液、3.5 mL蒸餾水，最后加入5 mL濃度100 mmol/L的H 2O 2啟動Fenton反應，搖勻后于510 nm處測定吸光度A 1；取0.5 mL的蒸餾水代替濃度10 mmol/L的FeSO 4溶液所測得的吸光度為A2；取0.5 mL的蒸餾水代替水解液所測得的吸光度為A3[13]。

羥自由基的清除率P(%)

式中：A1為樣品平均吸光值；A2為對照組平均吸光值；A3為空白組平均吸光值。

1.3.3 感官評價

參照GB/T 29605-2013，由10人組成評價小組，按表2指標對產品的色澤、味道、風味等進行綜合感官評價[14]。

表2 感官評定評分指標

2 結果與討論

2.1 乳清中的蛋白質質量濃度

以光密度讀數A為縱坐標，氨氮標準液氮含量C（μg）為橫坐標，繪制標準曲線，得到氨氮標準液氮含量C與吸光度A關系為A=0.0134C+0.007。

乳清樣品的吸光度A測定值為1.115，計算得蛋白質質量濃度為5.3 mg/mL。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 溫度對復合酶一步水解乳清得抗氧化肽的影響

由圖1可知，在其他因素相同的條件下，溫度為47.5，50，52.5℃時乳清多肽抗氧化性不高，羥基自由基清除率較低；當溫度為55℃時，羥自由基清除率達到最大值58.41%；一方面，溫度過低，不能使蛋白酶的特殊空間結構充分舒展，促使活性不能充分發揮[15]。另一方面，當溫度升高時，酶活力有所下降，導致蛋白質裂解肽鍵的速度減慢，小分子的肽數目減少，清除自由基的能力下降，所以乳清多肽的羥自由基清除率反而降低[16]。溫度的改變影響復合酶的活性，在適宜溫度范圍內，溫度升高，蛋白酶水解能力增強，進而影響具有抗氧化功能的酶解物含量。因此確定溫度55℃比較適合復合酶的一步酶解。

圖1 溫度對羥自由基清除率的影響

2.2.2 p H值對復合酶一步水解乳清得抗氧化肽的影響

由圖2可知，在其他因素相同的條件下，pH值為6時乳清多肽抗氧化性不高，羥基自由基清除率較低；當pH值為6.5時，羥自由基清除率達到最大值52.41%；當p H值不斷增大時，乳清多肽的羥自由基清除率反而不斷降低。溶液p H是決定復合蛋白酶催化活性的重要參數之一，過高或者過低都會對酶解反應產生不利影響，導致羥自由基清除率下降[17-18]。因此確定p H值為6.5是比較適合復合酶的一步酶解。

圖2 pH值對羥自由基清除率的影響

2.2.3 酶比對復合酶一步水解得抗氧化肽的影響

由圖3可知，在其他因素相同的條件下，酶比為1∶1和2∶1時乳清多肽抗氧化性不高，羥基自由基清除率較低；當酶比為3∶1時，羥自由基清除率達到最大值49.11%；當酶比增大時，乳清多肽的羥自由基清除率反而降低。酶比的改變影響酶解效果，每一種酶有專一的酶切位點，專一性不同的兩種酶組合起來，能更多地切斷多肽鏈，因而提高酶解效果[19]。因此確定酶比3∶1比較適合復合酶的一步酶解。

2.3 響應面實驗優化結果

圖3 酶比對羥自由基清除率的影響

表3 水解方案響應面分析及結果

采用響應面軟件設計3因素3水平的響應面優化實驗，以羥自由基清除率為響應值，結果如表3所示。

2.3.1 響應面分析及方差分析

根據表1,采用Design-Expert8.0.6軟件對表3中的試驗結果進行多元回歸擬合分析，對各因素回歸擬合后，得出羥自由基清除率對溫度（A）、pH值（B）、酶比（C)的回歸模型，回歸方程為：

由表4可以看出，A2和C2對羥基自由基清除率影響高度顯著，B2對羥基自由基清除率影響顯著，A對羥基自由基清除率影響較顯著。其中，失擬項=0.9909（＞0.05）即失擬項差異不顯著，表明該回歸模型能夠較顯著擬合。溫度、pH值、酶比對羥基自由基清除率的影響，該模型能夠代替試驗真實點對試驗結果進行分析。

2.3.2 最優水解條件的預測及驗證

運用Design-Expert8.0.6軟件對試驗數據進行優化預測，即對回歸方程取一階偏導數等于0，得到羥自由基清除率最高的最佳水解參數：溫度55.22℃，pH值為6.46，酶比31∶10，在此條件下羥基自由基清除率的值為68.08%。在此條件下對模型的預測參數進行3次平行驗證試驗，得到羥自由基清除率為67.70%，與模型預測值接近，表明采用響應面分析法優化得到的水解條件是可靠的。

表4 響應面ANOVA分析結果

2.3.3 響應面分析及優化

響應面可以反映出各因素間交互作用的顯著性，曲面變化相應表現為響應值變化的大小[20]。由圖4可知，溫度、pH值、酶比（中性蛋白酶：木瓜蛋白酶）3個因素之間存在交互作用。圖4（a）為溫度與p H值的交互結果：響應面曲面坡度較陡峭，且溫度更為陡峭，說明二者交互作用顯著，溫度的影響大于pH值的影響。圖4（b）為溫度和酶比的交互結果：響應面曲面坡度較陡峭，且溫度更為陡峭，說明二者交互作用顯著，溫度的影響大于酶比的影響。圖4（c）為p H值和酶比的交互結果：響應面較為平緩，且等高線呈圓形，說明兩者交互作用不顯著。

2.4 桑葚枸杞乳清多肽復合飲料配方優化的正交試驗結果

由表5可得，影響桑葚枸杞乳清多肽復合飲料風味的主次關系為B、A、C、D。正交試驗最適配方為A3B3C2D1，即檸檬酸0.13%、蜂蜜5.5%、桑葚4.0%、枸杞1.2%，該配方產品色澤均勻，口感酸甜，品質穩定。

表6表明，檸檬酸量、桑葚量、枸杞量對飲料最終口感的影響不顯著，而蜂蜜量對口感的影響顯著，直接影響飲料的酸甜風味。

3 結果與討論

目前，酶法制備乳清多肽一般都采用單一酶酶解制備的方法，如李雪等采用胃蛋白酶酶解乳清制備多肽[21]，唐艷等采用中性蛋白酶酶解乳清制備多肽[22]。但復合酶酶解乳清蛋白，可以結合不同酶的酶切位點，更多的切斷多肽鏈，促進酶解過程，提升乳清多肽的抗氧化性。多數乳清飲料研究采用乳清直接調配制備乳清飲料，如孟昭噓等以食用仙人掌、白糖等和乳清混合調配成仙人掌乳清飲料[23]。但利用乳清直接調配飲料時，熱處理往往導致乳清蛋白的變性沉淀，十分影響產品的感官特性和營養價值，而酶水解正是改善乳清蛋白溶解性的有效方法。

圖4 各因素交互作用對乳清多肽羥基自由基清除率影響的響應面

表6 感官評定方差分析結果

復合酶酶解制備抗氧化肽的最優酶解工藝條件為溫度為55.22℃，pH值為6.46，酶比（中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶）為31∶10。經過驗證與對比實驗可知在最優酶解工藝條件下羥自由基清除率可達到67.70%。且利用響應面分析三個因素的交互作用的影響順序是：溫度＞酶比＞pH值。以酶解的乳清液為基本原料制備的桑葚枸杞乳清多肽復合飲料配方為：桑葚4.0%，枸杞1.2%，檸檬酸0.13%，蜂蜜5.5%（均為質量分數）。