生鮮乳中嗜冷菌檢驗的兩種培養條件比較

吉玲

（上海旺旺食品集團有限公司，上海201103）

0 引言

牛乳營養豐富，同時也是微生物的良好培養基，屬于高營養易腐敗的食品。嗜冷菌是影響牛乳保質期的主要因素。嗜冷菌在原料乳低溫儲存運輸過程中可大量繁殖，其經過巴氏殺菌或UHT滅菌可以被殺滅，但其產生的耐熱酶[1]經過熱處理后仍然殘留。這些耐熱酶在乳制品儲藏銷售過程中被激活，會分解蛋白、脂肪，從而導致乳制品發生感官變化，出現脂肪上浮、蛋白沉淀、苦味、脂肪氧化味[2]等現象，給乳品品質造成較嚴重的不良影響。并且，嗜冷菌產生的耐熱酶使乳品中蛋白、脂肪等成分穩定性下降，加工過程中易在設備管路內表面結垢，尤其是導致板式熱交換器板片結垢嚴重，需要增加清洗強度及頻次，從而增加設備清洗成本及產能降低。生鮮乳中嗜冷菌的檢測和管控很有必要，并且也被國內外乳品企業及研究單位所關注。生乳中的嗜冷菌種類繁多，有細菌、放線菌、霉菌、低溫藻類等。細菌是數量和種類最多的一類，涉及30多個屬[3-11]。所以，嗜冷菌快速計數方法面臨針對性和全面性兩個挑戰性問題。低溫培養法是能篩選出嗜冷菌，較全面計數的較準確的方法。本實驗參照SN/T 2552.4-2010[12],通過大量對比實驗數據，比較了6.5℃10 d菌落計數[13]和21℃培養25 h菌落計數結果的差異，確認21℃培養25 h的嗜冷菌快速計數方法能否替代6.5℃培養10 d的計數方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

MLS-3751L-PC高溫高壓滅菌釜，日本三洋；lab dancer旋渦振蕩器，IKA；CA-1390-1超凈工作臺，上海上凈；SHP150生化培養箱，上海精宏；Galaxy 230菌落計數器，美國Sciencetool；HWS 12恒溫水浴鍋，上海一恒；DHG-9240A恒溫干燥箱，上海一恒。

乳平板計數瓊脂MPC，北京陸橋；磷酸鹽緩沖液，北京陸橋。

山東旺旺食品有限公司收購的生鮮乳，抽取樣品數90個，編號sample1、sample2、sample3、……、sample90。比對實驗分6日完成，每日實驗樣品數為15個。

1.2 實驗步驟

樣品稀釋：根據以往生鮮乳驗收嗜冷菌檢測實驗數據，收購的生鮮乳嗜冷菌含量一般在101～105CFU/mL范圍，故實驗取10-1、10-2、10-33個稀釋度的樣液接種。第一步稀釋，充分振蕩混勻初始生鮮乳樣品原液，無菌吸取樣品25 mL，加入225 mL的無菌磷酸鹽緩沖液中，充分振搖混合均勻，稀釋成10-1稀釋度的樣液；吸取10-1稀釋度樣液1 mL，加入9 mL無菌磷酸鹽緩沖液中，旋渦振蕩制成10-2稀釋度；吸取10-2稀釋度樣液1 mL，加入9 mL無菌磷酸鹽緩沖液中，制成10-3稀釋度的樣品勻液。

接種：10-1、10-2、10-3稀釋度，每個稀釋度接種4個平皿，每皿加樣1 mL，每皿傾注冷卻至46℃的無菌MPC培養基15 mL～20 mL。

培養：待瓊脂凝固干燥后，每個稀釋度2個平皿倒置于6.5±0.5℃生化培養箱培養10 d；另外2個只平皿倒置于21±1℃生化培養箱培養25 h。菌落觀察計數，選取菌落數在10～300 CFU內的平板計數，計算樣品中嗜冷菌含量。

2 結果與討論

2.1 實驗結果

90個生鮮乳樣品，經6.5℃培養10 d，21℃培養25 h，分別計數，計算嗜冷菌濃度。其中75個樣品，即83.3%比例的樣品，6.5±0.5℃10 d培養計數結果的對數值與21℃25 h培養計數結果的對數值之差的絕對值＞0.5 log10[14]，最大差異3.88 log10。

90個樣本中88個樣本，即97.8%比例的樣本，21℃25 h培養計數結果高于6.5℃10 d的計數結果，如下圖1所示。

圖1 生鮮乳6.5℃，10 d計數與21℃，25 h計數結果

6.5 ℃培養10 d，21℃培養25 h兩種條件培養計數結果之對數值，應用CORREL函數[15]，求得其相關系數僅為0.30；依兩種培養條件計數結果之對數值的相關方程為y=0.8377x-0.7552，相關系數的平方R2=0.0907，如圖2所示。由此可以看出6.5℃培養10 d、21℃培養25 h兩種條件培養計數結果為非相關性。

2.2 分析討論

圖2 生鮮乳6.5℃，10 d與21℃，25 h計數結果相關性

據本次實驗中90個生鮮乳樣本嗜冷菌檢測結果，6.5℃培養10 d計數與21℃培養25 h計數結果存在顯著差異（P＜0.01），因為兩種溫度條件可培養出的嗜冷微生物的種類不同。21℃培養25 h計數結果高于6.5℃培養10 d計數結果，可能因為21℃條件下除了專性嗜冷菌可生長，一些兼性嗜冷微生物也可被培養篩選出來。所以，兩種條件培養計數結果也不存在相關性。

乳品企業對生鮮乳中嗜冷菌監測時，可根據實際需要選擇相應的培養計數方法。若為了保障乳品品質，確保安全衛生，則可選擇21℃培養25 h計數的方法，該方法具有較大的包容性，可檢出較大范圍種類的嗜冷微生物群；若除了保障乳品的安全衛生，同時還需要研究和確認其實際專性嗜冷菌含量水平，以分析專性嗜冷菌含量與加工工藝及成品貨架期內品質的相關性，則選擇6.5℃培養10 d計數的方法可能更有意義。另外，乳品企業也可以在不同收購、儲存、加工等不同的管控環節，選擇相應的培養溫度時間進行嗜冷菌計數，例如，對于牧場生乳嗜冷菌含量檢驗時，則選擇21℃培養25 h計數的快速方法，有利于更迅速地評估各奶戶的生乳衛生狀態，以便發現問題，及時反饋，便于奶戶盡快改善。對于巴殺前奶倉中生乳混合奶樣的嗜冷菌檢測采用6.5℃培養10 d或6.5℃10 d與21℃培養25 h同步培養的實驗方案。

3 結語

生鮮乳中微生物含量的高低反映了其品質的優劣，為了保障消費者安全和健康，及降低乳品加工企業的經濟損失，對生乳原料中的嗜冷微生物的檢測及控制是有必要的。生鮮乳中嗜冷菌含量高時，在儲運過程繼續大量繁殖，則會產生大量的耐熱酶類，導致乳中蛋白、脂肪、乳糖等營養成分分解，從而使UHT工藝過程面臨較大的挑戰，也會影響貨架期內產品的風味、穩定性。乳品企業期望嗜冷菌能作為常規驗收項目，但現行的培養計數技術需要的檢測周期至少25 h，不適用于生鮮乳的實時驗收。所以乳品行業迫切需要一個精確可靠，靈敏度高的，可操作性高，且成本低的，好的嗜冷菌快速檢測方法。