超高效液相色譜
——串聯質譜法測定畜禽肉中多種磺胺類藥物殘留

向 俊

(湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410111)

磺胺類藥物(SAs)價廉易得、抗菌力強且能迅速完全吸收，因而在畜牧業及獸醫臨床畜禽細菌性疾病的預防與治療中得到廣泛應用。然而，磺胺類藥物會在體內存在較長的代謝時間，易蓄積在人體內，一旦超出某個值的蓄積濃度，就會危害人體健康。長時間小劑量或短時間大劑量蓄積，會引發慢性或急性中毒，導致機體免疫、泌尿系統受到影響，對肌肉、甲狀腺及腎臟等組織產生損害。本文選擇UPLC-MS/MS法，對畜禽肉內8種SAs殘留同時進行了測定。

1 試驗材料

1.1 材料

WatersXevo TQ-S超高效液相色譜——串聯質譜儀；TTL-DCⅡ氮吹儀；T18均質機；Allegra 64R高速冷凍離心機；Milli-Q超純水系統[1]。

8種磺胺類藥物標準品：磺胺醋酰(STD)、磺胺甲噻二唑(STZ)、磺胺二甲異惡唑(SIX)、磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲基異惡唑(SMZ)、磺胺噻唑(ST)、磺胺甲基嘧啶(SMR)(純度≥99%)。異丙醇、無水硫酸鈉(分析純)；正己烷、乙腈、乙酸銨(色譜純)；650℃環境下灼燒無水硫酸鈉，持續4h，轉至干燥器備用。實驗室用水為Milli-Q超純水。

豬肉、牛肉、羊肉、雞肉(當地市場購買)。

1.2 儀器條件

色譜分析條件：Waters BEH-C18色譜柱，2.1mm×100mm，1.7μm；乙腈為A相，pH=7.0、10mmol·L-1的乙酸銨水溶液為B相，柱溫35℃、流速0.4mL·min-1、進樣體積10μL；梯度洗脫程序，0～5.0min—95%～85%B，5.0～7.0min—85%～45%B，7.0～7.5min—45%～95%B，10min—95%B。

質譜分析條件：電噴霧電離ESI(+)(離子源)，接口電壓3.5kV，溫度120℃；電子倍增電壓650V；脫溶劑氣溫度350℃；霧化氣，氮氣600L·min-1；碰撞氣，氬氣；掃描模式，多反應監測模式。

2 實驗方法

2.1 標準溶液配制

配制1mg·mL-1的標準儲備液：在多個10mL容量瓶內分別放入精確量取的8種SAs標準品各10.00mg，用甲醇定容至刻度，保存至冰箱(-20℃)。

配制1μg·mL-1的混合標準工作液：在同一容量瓶內放入適量的上述儲備液，用甲醇稀釋后，保存至冰箱(4℃)。

2.2 樣品前處理

動物組織在均質機內均勻化絞碎后，精確稱取5.00g放入塑料離心管(50mL)內，按先后順序加入無水硫酸鈉20g、乙腈20mL，經渦旋混勻后超聲提取30min，隨后進行離心，8000r·min-1，10min。收集上清液，轉入雞心瓶(150mL)，殘渣用20mL乙腈(無水硫酸鈉除水)清洗，收集上清液，轉入雞心瓶。將提取液合并，移至旋轉蒸發器內，在水浴(50℃)條件下濃縮，約1mL時放入離心管(10mL)。雞心瓶內的殘渣用2mL乙腈溶解后，轉至離心管內合并，吹干有機相(40℃氮氣保護)。加入1mL初始流動相，渦旋1min后溶解殘渣。乙腈飽和正己烷1mL充分渦旋，復溶液重復1～2次萃取，將脂肪去除。將上層有機相摒棄，下層清液過濾(濾膜：0.22μm)，待測。

3 結果與分析

3.1 質譜條件確定

采取流動注射方式，于正離子模式下將8種100mg·L-1濃度的磺胺類藥物進行質樸參數調諧優化。掃描各種化合物母離子，將分子離子確定后，手動進行錐孔電壓的調節，得到不同目標物在響應值最大的條件下所對應的錐孔電壓值[2]。以此為基礎對子離子碰撞能量進行優化，通過調節子離子質譜信號豐度，得到子離子碰撞最佳電壓，干擾偏低、豐度較強的子離子作為定量定性離子。

3.2 色譜條件確定

SAs含有弱堿性氨基，所以對流動相pH值調節，可對弱堿離解發揮抑制作用，改變保留時間。鑒于pH>5的磺胺類藥物會有負電荷，選擇pH值為7.0的固定流動相乙酸鈉水溶液。通過試驗結果得知，11min內，8種磺胺類藥物分離完全，保留時間重現性良好，且具有理想峰型。

3.3 方法線性范圍及檢出限

通過空白基質加標制備混合標準溶液方式的應用，可在一定程度上弱化離子化基質效應，有利于定量結果準確性的提高。精確稱取5.00g陰性樣品共6份，提取方法按照上述處理方法進行，獲取空白基質液，配制濃度不同的混合標準溶液，分別為5ng·mL-1、10ng·mL-1、20ng·mL-1、80ng·mL-1、100ng·mL-1，構建標準工作曲線，橫坐標為SAs濃度，峰面積則為縱坐標，取得線性回歸方程，根據表1得知，該方法在5～100ng·mL-1范圍內，線性關系較好。在空白樣品內依次加入8種SAs標準溶液，得知該方法目標物的檢出限和定量限分別為2μg·kg-1、5μg·kg-1。

3.4 方法回收率與精密度

表1 8種磺胺類藥物殘留檢測方法線性范圍及檢出限

在空白基質內分別將8種SAs混合標準溶液加入，執行2.2中樣品前處理方法后，實施添加回收率及精密度試驗，對回收率及相對標準偏差進行計算[3]。根據表2數據得知，8種磺胺類藥物在添加水平為10μg·kg-1、20μg·kg-1、100μg·kg-1時，分別得到84.0%～114.2%和0.73%～7.96%的平均回收率與RSD。

3.5 實際樣品測定

對本地市場購買的雞肉、豬肉、羊肉及牛肉進行抽檢，實際樣品內并未檢測出殘留磺胺類藥物[4]。為對方法適用性加以驗證，實施加標試驗測定，試驗對象為雞肉、羊肉及牛肉，回收率不低于80%。

表2 空白基質中8種磺胺類藥物添加回收率及精密度(n=6)

4 結論

超高效液相色譜——串聯質譜法為一種靈敏快速、準確度高、分離范圍廣的檢測方法，其對樣品的要求較低，對化合物結構破壞小，適用有機分子和生物分子的分離。由于獸藥殘留的多樣化及其復雜程度，檢測獸藥殘留不僅限于一種藥物殘留的監測，單類監測獸藥殘留具有效率低、耗時長的缺點，因此超高效液相色譜串聯質譜法被廣泛應用于獸藥的檢測中。

本實驗中，經乙腈提取、濃縮后的樣品，正己烷脫脂下用電噴霧電離串聯質譜展開測定。通過檢測結果得知，該方法前處理簡單，檢出限低，具有較好的重現性，在畜禽肉磺胺類藥物殘留測定中，可最大限度滿足實際工作需求。