牛黃對治療腦梗死的調控網絡和潛在機制研究

梁玉華 何花花 鄧太平

[摘要]目的 運用網絡藥理學的方法預測牛黃治療腦梗死的潛在靶點，探討其調控網絡及作用機制。方法 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫和文獻挖掘獲取牛黃的主要活性成分，利用人類基因數據庫GeneCards預測和篩選牛黃活性成分的作用靶點。采用String數據庫和Cytoscape 3.7.1軟件繪制蛋白相互作用（PPI）網絡，借助DAVID6.8數據庫進行潛在基因的基因本體論（GO）分析。結果 篩選得到牛黃5個活性成分，涉及3個作用靶點。GO分析結果顯示，牛黃治療腦梗死的生物過程主要涉及類固醇激素受體活性、核受體活性、轉錄因子活性、類固醇結合、維生素D受體結合、核受體結合、染色質DNA結合、ATP酶結合等。結論 牛黃治療腦梗死是一個多成分、多靶點的復雜過程，主要通過調控NR3C2、PGR、RXRA這3個靶點，涉及核受體活性、轉錄因子活性、類固醇結合、維生素D受體結合、染色質DNA結合、ATP酶結合等生物過程而發揮干預腦梗死的作用。

[關鍵詞]網絡藥理學;牛黃;腦梗死;潛在機制

[中圖分類號] R282? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）7（a）-0008-04

Study on the regulatory network and potential mechanism of Bezoar in the treatment of cerebral infarction

LIANG Yu-hua1? ?HE Hua-hua2? ?DENG Tai-ping3

1. Department of Pharmacy， Huizhou Municipal Central People′s Hospital， Guangdong Province， Huizhou? ?516001， China; 2. Department of Neurology， Huizhou Traditional Chinese Medicine Hospital， Guangdong Province， Huizhou? ?516001， China; 3. Department of Internal Medicine， Traditional Chinese Medicine Hospital of Boluo County in Huizhou City， Guangdong Province， Boluo? ?516100， China

[Abstract] Objective To predicit the potential target of Bezoar in the treatment of cerebral infarction via network pharmacology and to explore its regulatory network and mechanism of action. Methods The main active components of Bezoar were were obtained through traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform （TCMSP） database and literature mining， and the target of the active ingredients of Bezoar was predicted and screened using the human gene database GeneCards. String database and Cytoscape 3.7.1 software were used to draw protein interaction （PPI） network， and gene ontology （GO） analysis of potential genes was performed with the application of DAVID6.8 database. Results A total of 5 active ingredients of Bezoar were obtained by screening， involving 3 targets. GO analysis results showed that the biological process of Bezoar in the treatment of cerebral infarction mainly involved steroid hormone receptor activity， nuclear receptor activity， transcription factor activity， steroid binding， vitamin D receptor binding， nuclear receptor binding， chromatin DNA binding， and ATPase binding， etc. Conclusion The treatment of cerebral infarction by Bezoar is a complex process with multiple components and multiple targets， mainly by regulating the three targets of NR3C2， PGR and RXRA， involving nuclear receptor activity， transcription factor activity， steroid binding， vitamin D receptor binding， chromatin DNA binding， ATPase binding and other biological processes to play a role in intervening cerebral infarction.

[Key words] Network pharmacology; Bezoar; Cerebral infarction; Potential mechanism

腦梗死是指各種原因引起腦部血液循環障礙，缺血、缺氧所致的局限性腦組織的缺血性壞死或軟化，而出現相應的神經系統功能缺損，又稱缺血性腦卒中[1]，是臨床上常見的一種心腦血管疾病，具有發病急驟，致死、致殘率高等特點[2]。腦梗死超過48 h病情逐漸惡化、加重，稱為進展性腦梗死（progressive cerebral infarction，PCI）[3]。目前臨床主要是采取常規藥物治療，包括抗凝、溶栓、抗血小板等，但對患者神經功能恢復難以取得較為理想的效果。腦梗死屬于中醫學“中風”范疇，其發病常與風、火、痰、虛、瘀等因素相關。“中風”為本虛標實、上盛下虛之證，雖有本虛，但標實更為突出，應以“急則治其標”為原則，分別以平肝熄風、清熱滌痰、化痰通腑、活血通絡、醒神開竅等法。目前，中醫藥在治療腦梗死取得良好的效果，顯示了廣闊的前景。有文獻報道，安宮牛黃丸、體外培育牛黃等牛黃制劑具有明顯改善腦缺血癥狀，減輕腦損傷的作用[4-5]。據文獻顯示，牛黃有清心解毒、豁痰開竅功能，能調節中樞神經介質兒茶酚胺的活性，從而恢復腦干網狀結構上功能，達到醒神復蘇的作用[6]。牛黃（Calculus Bovis）是我國傳統名貴中藥，又名“土精”“丑寶”，最早載于《神農本草經》，列為上品，距今已有兩千多年歷史[7]。牛黃天然來源于哺乳綱偶蹄目牛科脊椎動物牛的膽囊、膽管以及肝管中的結石，其性涼、味苦，具有清熱解毒、熄風止痙、化痰開竅的功效。牛黃在治療熱病神昏、中風痰迷等方面均有較好的效果，但其潛在機制不明確，因此借助網絡藥理學的方法篩選牛黃的活性成分，挖掘牛黃干預腦梗死的作用靶點以闡明其作用機制，為臨床應用提供重要的理論依據。

1資料與方法

1.1牛黃活性成分的獲取和篩選

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）可以從整體水平研究藥物靶標網絡和疾病網絡，為揭示中藥性質與作用機制的平臺[8]。從TCMSP數據庫獲取牛黃的化學成分，輸入關鍵詞“牛黃”，得到活性成分信息。口服給藥是中藥制劑最常見的給藥途徑[9]，口服生物利用度（OB）是評價中藥臨床藥效的有效指標，是藥物吸收、分布、代謝、排泄的關鍵指標之一，也是決定活性組分類藥性的關鍵指標。類藥性（DL）>0.18的化合物被認為是具有較高的DL并選為候選分子進行研究[10]。因此本研究通過OB和DL兩個指標對牛黃活性成分進行篩選，以OB>30%和DL>0.18[11]為限定條件，在TCMSP中篩選出符合上述2個條件的成分為牛黃活性較高的的化學成分。

1.2預測潛在靶點

從TCMSP數據庫中檢索出牛黃活性成分的作用靶點，作為候選藥物的作用靶點。然后通過Uniprot數據庫（http：//www.uniprot.org/）將候選藥物靶點轉換成基因名稱。以“cerebral infarction”為關鍵詞，通過GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）搜索與腦梗死相關的基因。將挖掘到的cerebral infarction相關基因與藥物的靶點基因映射篩選得出共同基因，從而得到牛黃活性成分治療腦梗死的相關作用靶標。

1.3活性成分-疾病靶點構建

將候選化學成分與cerebral infarction靶點通過Cytoscape 3.7.1建立牛黃的化合物-腦梗死靶點群網絡，每個節點（node）是基因、蛋白質或分子;節點與節點之間的連線（edge）代表著這些生物分子之間的相互作用，根據化合物與靶點連接情況篩選出牛黃作用腦梗死的關鍵化合物。

1.4蛋白相互作用（PPI）網絡構建

將藥物活性成分-疾病的交集靶點導入String數據庫（https：//string-db.org/），以構建牛黃治療腦梗死PPI網絡[12]。限定物種為“homo sapiens”（人類），設定最低相互作用閾值為中等置信度0.4“medium confidence”，其余參數保持不變，得到蛋白相互作用關系，結果保存為TSV格式。使用Cytoscape 3.7.1軟件將活性成分-靶點網絡與腦梗死相關靶點相互作用網絡融合，取交集部分，獲得最終的蛋白相互作用網絡。

1.5基因本體論（gene ontology，GO）功能分析

GO是用于描述基因產物功能并且廣泛應用于生物信息學領域的一個本體[13]。將藥物-疾病交集基因導入DAVID6.8數據庫[14]，輸入靶基因名稱列表，限定物種為“homo sapiens”，將靶點基因修正為官方名稱（“official gene symbol”），設定閾值P<0.05，進行GO生物過程富集分析，結果用R語言分析作圖。

2結果

2.1牛黃活性成分及靶點的篩選

TCMSP中以OB%>30，DL>0.18為篩選條件獲得5個牛黃活性成分，結果見表1。逐一對應靶點，得到牛黃活性成分靶點133個。

2.2疾病潛在靶點獲取結果

從GeneCards數據庫中檢索到2611個腦梗死相關靶點基因。

2.3網絡構建與分析結果

將牛黃活性成分對應靶點與腦梗死相關作用靶點取交集得到活性成分-疾病靶點基因3個，對應牛黃5個活性成分。利用Cytoscape 3.7.1軟件構建中藥化合物-靶點相互作用網絡，具體見圖1（封三）。

2.4 PPI網絡的構建及關鍵靶點篩選

將映射得到的靶點基因輸入String數據庫中進行PPI網絡分析，得到蛋白相互作用網絡圖，如圖2（封三）所示。PPI網絡包括了3個靶蛋白節點，共有3條邊代表了蛋白之間的相互作用，處于該蛋白質-蛋白質相互作用網絡中心的蛋白質有NR3C2、PGR、RXRA，可能是牛黃干預腦梗死的重要靶點。

2.5 GO功能分析

3個藥物活性成分-疾病交集基因影響了19個生物學過程（P<0.05）（表2、圖3，封三）。結果顯示，牛黃的活性成分主要富集在類固醇激素受體活性、核受體活性、轉錄因子活性、類固醇結合、RNA聚合酶Ⅱ近端啟動子序列特異性DNA結合、近端啟動子序列特異性DNA結合、維生素D受體結合、類維生素A結合、類異戊二烯結合、一元羧酸結合、染色質DNA結合、ATP酶結合等方面。

3討論

網絡藥理學是融合系統生物學、多向藥理學、計算生物學及網絡分析等多學科的技術和內容，進行“疾病-基因-藥物”的網絡構建，從整體的角度去探討藥物與疾病的相關性，因此本研究借助網絡藥理學的方法，對牛黃干預腦梗死的潛在作用機制進行探討。本次研究收集到與牛黃干預腦梗死的相關活性成分有脫氧膽酸甲酯（Methyl desoxycholate）、Deoxycholic Acid、ZINC01280365、CLR等。利用GeneCards數據庫得到2611個腦梗死的相關靶點，通過映射找到了NR3C2、PGR、RXRA這3個牛黃干預腦梗死的潛在治療靶點。同時利用String數據庫進行靶蛋白相互作用網絡分析，發現這些靶蛋白之間存在著相互聯系，由此推測靶點之間的相互調節可能是牛黃治療腦梗死的潛在機制。進一步提煉牛黃干預腦梗死的生物學過程，發現其靶點主要富集在類固醇激素受體活性、核受體活性、轉錄因子活性、類固醇結合、維生素D受體結合、核受體結合、染色質DNA結合、ATP酶結合等生物學過程，這與腦梗死的發生發展有一定的聯系。

有研究表明，Na+-K+-ATP酶活性對神經元損傷起到關鍵的作用[15]，Na+-K+-ATP酶活性的降低會加重腦組織水腫程度，誘發神經元凋亡，最終導致腦梗死面積擴大，從而影響神經功能的恢復[16]。因此，從本次GO功能分析研究結果推測牛黃的活性成分可能通過保護并提高ATP酶結合活性，以減輕腦水腫和減少神經元凋亡，從而起到干預腦梗死的作用。目前，牛黃活性成分通過何種途徑增加Na+-K+-ATP酶活性尚不明確，還需要進一步的研究探討。另有研究顯示，維生素D水平低下與腦梗死發病、進展以及不良預后發生率有密切的相關性[17-18]。亦有研究表明，維生素D可通過多種途徑對神經細胞起到保護作用，主要能釋放神經營養因子以及免疫調節減弱炎癥反應來保護神經[19]，亦可抑制PAI-1等凝血因子來抑制血栓形成，改善腦梗死的嚴重程度，避免神經功能進一步損傷[20]。由此推測在其參與的生物功能過程中，牛黃活性成分可能通過干預維生素D受體結合活性，起到神經保護和抗氧化效應的作用，從而干預腦梗死的發生發展。

綜上所述，通過成分、靶點、生物過程的作用網絡分析，發現牛黃的作用也是多靶點多途徑的過程，說明牛黃作用機體不是單一的，有可能是復雜、系統的作用，符合腦梗死病理生理復雜的發展過程，但由于數據庫信息不完全，有些化合物可能會被忽略，一些活性成分可能會在篩選過程中被遺漏，關鍵基因的提取也是基于一定的算法，有一定的局限性，篩選出的關鍵基因以及具有預測作用的基因均需要進一步試驗驗證。

[參考文獻]

[1]常虹.腦梗死的治療現狀及進展分析[J].繼續醫學教育，2019，33（1）：55-57.

[2]Gold AB，Herrmann N，Lanctot KL.Lithium and its Neuroprotective and Neurotrophic Effects：Potential Treatment for Post-Ischemic Stroke Sequelae[J].Curr Drug Targets，2011， 12（2）：243-255.

[3]王維治.神經病學[M].2版.北京：人民衛生出版社，2013：918.

[4]劉曉明，高善語.安宮牛黃制劑治療老年急性腦梗死的臨床觀察[J].光明中醫，2016，31（17）：2462-2465.

[5]劉曉燕，彭凱潤，楊紅軍，等.體外培育牛黃治療急性腦梗死臨床療效觀察[J].中國中醫藥信息雜志，2010，17（5）：66-67.

[6]許再玲.安宮牛黃丸和肝安治療重型極重型流行性乙型腦炎80例[J].浙江中醫雜志，1995，（7）：302-303.

[7]柯榮勛.牛黃及其偽品的鑒別[J].江西中醫藥，2007，38（11）：57-58.

[8]汝錦龍.中藥系統藥理學數據庫和分析平臺的構建和應用[D].咸陽：西北農林科技大學，2015.

[9]李明玥，倪健，尹興斌.改善中藥口服生物利用度的制劑技術研究進展[J].中華中醫藥學刊，2016，34（2）：307-311.

[10]劉惠.基于系統藥理學的甘草作用機制和新藥發現研究[D].咸陽：西北農林科技大學，2013.

[11]Li J，Zhao P，Li Y，et al.Systems pharmacology-based dissection of mechanisms of Chinese medicinal formula Bufei Yishen as an effective treatment for chronicobstructive pulmonary disease[J].Sci Rep，2015，5：15 290.

[12]Von Mering C，Jensen LJ，Snel B，et al.STRING：known and predicted protein-protein associations，integrated and transferred across organisms[J].Nucleic Acids Res，2005，33（Database issue）：D433-D437.

[13]Martucci D，Masseroli M，Pinciroli F.Gene ontology application to genomic functional annotation，statistical analysis and knowledge mining[J].Stud Health Technol Inform，2004，102：108-131.

[14]Huang DW，Sherman BT，Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources[J].Nat Protoc，2009，4（1）：44-57.

[15]Pierre SV，Yang C，Yuan Z，et al.Ouabain triggers preconditioning through activation of the Na+，K+-ATPase signaling cascade in rat hearts[J].Cardiovasc Res，2007，73（3）：488-496.

[16]藺心敬，張麗香，羅永堅，等.Na+-K+-ATP酶活性與缺血半暗帶腦組織缺血再灌注損傷的研究[J].中華老年心腦血管病雜志，2013，15（3）：302-304.

[17]Kojima G，Bell C，Abbott RD，et al.Low Dietary Vitamin D Predicts 34-Year Incident Stroke The Honolulu Heart Program[J].Stroke，2012，43（8）：2163-2167.

[18]Sun Q，Pan A，Hu FB，et al.25-hydroxyvitamin D levels and risk of stroke：A prospective study and meta-analysis[J].Stroke，2012，43（6）：1470-1477.

[19]Cui X，Gooch H，Petty A，et al.Vitamin D and the brain：Genomicand non-genomic actions[J].Mol Cell Endocrinol，2017，453（5）：131-143.

[20]Jorde R，Sneve M，Torjesen P，et al.Parameters of the thrombogram are associated with serum 25-hydroxyvitamin D levels at baseline，but notaffected during supplementation with vitamin D[J].Thromb Res，2010，125（5）：e210-e213.

（收稿日期：2020-03-05）