美洲大蠊萃取液對(duì)面部蠕形螨作用的觀察與分析研究

成 云，魏質(zhì)鑫，張 倩，鄒玉鳳，楊 倩，紹維在，楊毅梅

（1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南騰藥制藥股份有限公司，云南騰沖 679100；3.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

蠕形螨（follicle mite）又名毛囊蟲，在分類上屬真螨目蠕形螨科（Demodicidae），是一類永久性寄生蟲。蠕形螨發(fā)育的最適溫度為37℃，可通過直接或間接接觸而傳播。寄生于人體的蠕形螨僅兩種，即毛囊蠕形螨（Demodex folliculorum）和皮脂蠕形螨（D.brevis），此兩種蠕形螨發(fā)育、形態(tài)和致病機(jī)理基本相似。

蠕形螨致病機(jī)理主要有機(jī)械性刺激、繼發(fā)細(xì)菌感染和免疫病理作用3類。蠕形螨在皮膚內(nèi)活動(dòng)時(shí)對(duì)上皮細(xì)胞和腺細(xì)胞造成機(jī)械性破壞。蠕形螨可引起毛囊擴(kuò)張，上皮變性，當(dāng)寄生蟲體較多時(shí)，可引起其寄生的毛囊、皮脂腺角化過度或角化不全，皮脂腺分泌阻塞及真皮層毛細(xì)血管增生等病變，蟲體的機(jī)械刺激和其分泌物、代謝物的化學(xué)刺激可引起皮膚組織的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致宿主局部皮膚的非細(xì)菌性炎癥反應(yīng)。此外，蟲體代謝物可引起變態(tài)反應(yīng)，蟲體的進(jìn)出活動(dòng)攜帶其他病原微生物進(jìn)人毛囊或皮脂腺可致繼發(fā)感染，引起毛囊周圍細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生。

人體蠕形螨呈世界性分布，國(guó)外報(bào)告人群感染率為27%～100%，國(guó)內(nèi)人群感染率一般在20%以上，最高可達(dá)97.86%。人體蠕形螨對(duì)外界環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，日常生活中使用的肥皂、化妝品等均對(duì)人體蠕形螨不具殺滅作用。近年來，國(guó)內(nèi)外蠕形螨的感染率逐漸升高，部分大學(xué)中的學(xué)生感染率可高達(dá)50%〔1-3〕。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)生活質(zhì)量的要求提高，越來越重視蠕形螨對(duì)面部皮膚的損害，治療的需求日益增加。治療蠕形螨引起的肌膚問題也逐漸成為科學(xué)工作者研究的方向，越來越多的學(xué)者轉(zhuǎn)向了中醫(yī)中藥對(duì)面部蠕形螨的作用研究〔4-8〕。本課題組在查閱大量資料基礎(chǔ)上，進(jìn)行了美洲大蠊萃取液對(duì)面部蠕形螨作用的觀察與分析研究實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料美洲大蠊萃取液（以下簡(jiǎn)稱“萃取液”，云南騰藥制藥股份有限公司提供）；空白基質(zhì)、甘油、蒸餾水。

1.2方法

1.2.1 取材對(duì)象 通過咨詢大理大學(xué)下關(guān)校區(qū)臨床醫(yī)學(xué)院、護(hù)理學(xué)院、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院在校學(xué)生150余人，成功招募82名志愿者參與面部是否感染蠕形螨的檢查實(shí)驗(yàn)，采用透明膠帶法得到21名陽(yáng)性志愿者參與后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 取材方法 蠕形螨取材常用方法包括：①透明膠帶粘貼法；②擠壓刮拭法；③擠粘結(jié)合法。本實(shí)驗(yàn)需要多次取材、反復(fù)觀察與分析美洲大蠊萃取液對(duì)人體面部蠕形螨作用，因擠壓刮拭法與擠粘結(jié)合法取材標(biāo)本無(wú)法保存，且對(duì)受試者皮膚有所損傷，故本課題采用了透明膠帶粘貼法自受檢者面部獲取蠕形螨。

1.2.3 確診方法 將透明膠帶平貼于載玻片上，并在膠帶上注明粘貼部位（如：額頭，左頰，右頰，下頜），發(fā)給受檢者，讓受檢者晚上睡覺前用清水洗臉，待干后，把透明膠帶分別粘貼于相應(yīng)部位。囑受檢者晚上睡覺盡量采取仰臥位，避免膠帶脫落而影響檢查結(jié)果。次日早晨取下膠帶后，貼回原載玻片上，所得樣本及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室鏡檢，用碳素筆直接在膠帶上圈出螨蟲所在位置，并記錄結(jié)果〔9〕。

1.2.4 “針刺給藥殺螨法”的產(chǎn)生及應(yīng)用 透明膠帶粘貼法獲取螨蟲后，螨蟲緊密粘貼于膠帶上，液態(tài)藥物如何給藥是該實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，若取下膠帶給藥，蟲體與膠帶將分離，這樣會(huì)造成螨蟲破損及遺失，無(wú)法判斷藥物效果；由于不易確定螨蟲位置，無(wú)法準(zhǔn)確給藥。課題組經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)摸索，發(fā)現(xiàn)直接用注射器向膠帶下圈內(nèi)給藥，能使藥物與螨蟲充分接觸以發(fā)揮藥物作用，不會(huì)造成螨蟲遺失，易再次查找螨蟲位置。因該方法以注射定點(diǎn)殺螨觀察為特點(diǎn)，特取名“針刺給藥殺螨法”。

應(yīng)用“針刺給藥殺螨法”進(jìn)行效果實(shí)驗(yàn)。在顯微鏡下選取活動(dòng)活躍的蠕形螨24只，隨機(jī)分為3組，每組8只。用注射器分別向其中兩組膠帶下加入50%和60%的萃取液，另外一組加蒸餾水作為空白對(duì)照組。將加好藥的樣品置于37℃的恒溫箱中，每5 min觀察一次，仔細(xì)觀察蠕形螨的活動(dòng)情況和死亡情況，并詳細(xì)記錄加藥后蠕形螨的死亡時(shí)間和蟲體的變化情況。

1.2.5 “針刺給藥殺螨法”體外實(shí)驗(yàn) 確定不同濃度萃取液對(duì)面部蠕形螨的殺傷作用且確定最適殺螨濃度。標(biāo)注蠕形螨透明膠帶玻片標(biāo)本號(hào)。隨機(jī)平均分為7組，分別記為1組～7組。1組用藥為空白基質(zhì)，2組用藥為1%萃取液，3組用藥為2%萃取液，4組用藥為3%萃取液，5組用藥為4%萃取液，6組用藥為5%萃取液，7組用藥為6%萃取液。分別在低倍顯微鏡下計(jì)數(shù)各組玻片活螨成蟲個(gè)數(shù)。將上述不同濃度萃取液分別用注射器加到各標(biāo)本膠帶下，使萃取液與蟲體充分接觸，置于37℃恒溫箱中，每隔6 h用顯微鏡觀察螨蟲死亡情況。

1.2.6 感染者面部用藥 根據(jù)“針刺給藥殺螨法”確定的最適濃度，并于試驗(yàn)前14 d告知受試者（面部蠕形螨檢查陽(yáng)性志愿者）停用一切口服及外用藥物。每天晨起和晚睡前各用藥1次，用藥前用溫水洗臉、拭干，然后分別滴加萃取液并將其涂于整個(gè)感染部位，輕揉片刻。分別于用藥后1、3和7 d用透明膠帶取螨法取螨觀察，分別記錄玻片上所有螨蟲數(shù)及死亡、存活的螨蟲數(shù)。觀察受試者面部感染部位用藥后蠕形螨查蟲數(shù)量的變化以及皮膚的改善情況。

1.3蠕形螨死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)“針刺給藥殺螨法”給藥使螨蟲與萃取液充分接觸，在400×顯微鏡下觀察到蟲體收縮、透明，蟲體螯肢和足停止活動(dòng)，用解剖針觸之不動(dòng)，蟲體破裂，外周有油滴樣堆積物。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行分析，采用Pearsonχ2檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1萃取液對(duì)面部蠕形螨的殺傷效果分析分別選8只活動(dòng)明顯的蠕形螨進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。加藥前高倍鏡觀察蠕形螨，頭、足均有活動(dòng)。加入50%萃取液10 min后有蠕形螨死亡，35 min后全部死亡；加入60%萃取液15 min后有蠕形螨死亡，35 min后全部死亡。見表1。

表1 “針刺給藥殺螨法”實(shí)驗(yàn)效果觀察

2.2不同濃度萃取液體外實(shí)驗(yàn)殺螨最適濃度的確定萃取液有很好的面部殺螨作用，濃度為6%、3%、2%的萃取液有100.00%殺螨效果，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ26%=8.57、χ23%=13.50、χ22%=14.70，P＜0.05）。由此可見，6%，3%，2%濃度的萃取液殺螨效果較好，考慮到藥物成本，取最小殺螨濃度2%為最適濃度。見表2。

表2 不同濃度萃取液體外實(shí)驗(yàn)效果觀察

2.3受試者用藥后情況分析21名陽(yáng)性志愿者中，僅有8名愿意參加面部用藥。8名受試者面部感染部位用藥以后，皮膚潮紅的癥狀有不同程度的改善。在用藥3 d后，其中2名受試者面部查蟲出現(xiàn)陰性結(jié)果，4名受試者面部查蟲死亡率明顯降低，1名受試者面部查蟲死亡率明顯升高，1名受試者面部查蟲死亡率不變。用藥7 d后，有4名受試者面部查蟲出現(xiàn)陰性結(jié)果，2名受試者面部查蟲死亡率明顯降低，1名受試者面部查蟲死亡率明顯升高，1名受試者面部查蟲死亡率不變。見表3。

3 討論

當(dāng)前人體蠕形螨感染呈世界性分布且逐年增高。近年來，專家學(xué)者對(duì)蠕形螨進(jìn)行的研究主要包括使用化學(xué)合成藥物、天然提取藥物等〔10-12〕。但是這些藥物療效差，或長(zhǎng)期使用有一定毒性及對(duì)皮膚有刺激性，破壞了皮膚的營(yíng)養(yǎng)狀況造成對(duì)皮膚的損傷。此外，市場(chǎng)上出售的除螨護(hù)膚品中，大多數(shù)添加劑主要集中在金盞花、金縷梅、金銀花、茶樹提取物上，這些植物的提取液主要作用集中在抑菌、控油，僅僅通過抑制油脂分泌達(dá)到防螨、治螨的目的。抑螨途徑單一而且效果不佳，除此之外還破壞了皮膚的營(yíng)養(yǎng)狀況造成對(duì)皮膚的損傷〔12〕。本實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)估萃取液對(duì)蠕形螨的殺傷作用，探索效果最好、副作用最小的殺螨濃度，并能夠應(yīng)用于臨床起到治療作用。

表3 2%萃取液面部殺螨效果觀察［n（%）］

實(shí)驗(yàn)采用透明膠帶粘貼法獲得蠕形螨，此法檢獲率較高，容易鏡下觀察，且不會(huì)對(duì)受檢者面部皮膚造成影響，于體外實(shí)驗(yàn)時(shí)不受濕度和空氣的影響，但是不易給藥，若撕下膠帶給藥，會(huì)造成螨蟲的遺失和移位且易損傷蟲體，故本實(shí)驗(yàn)自行設(shè)計(jì)了“針刺給藥殺螨法”。在摸索“針刺給藥殺螨法”的過程中，嘗試了多種方法，如將取得標(biāo)本的透明膠帶查蟲后直接撕取然后涂藥，再次顯微鏡下觀察，找不到原來標(biāo)記的相同位置的蠕形螨，且查蟲的難度包括顯微鏡下的清晰程度和尋找難度均變高；透明膠帶扎孔滴加藥物的嘗試中，藥物無(wú)法進(jìn)入膠帶和玻片之間，不能與螨蟲接觸，無(wú)法觀察藥物效果。在多次反復(fù)試驗(yàn)后，摸索出“針刺給藥殺螨法”，注射器吸取萃取液，在已經(jīng)標(biāo)記出面部蠕形螨位置的圈邊刺入，針頭朝圈心，緩慢注射藥物，使得藥物浸入整個(gè)圈中，進(jìn)入玻片和膠帶之間且使得其與面部蠕形螨充分接觸，并且面部蠕形螨蟲體不發(fā)生較大的移動(dòng)，便于觀察，以準(zhǔn)確獲取蟲體用藥后的活性數(shù)據(jù)。

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萃取液有很強(qiáng)的體外殺螨作用，但由于所用萃取液濃度（60%和50%）過高，不宜直接用于面部實(shí)驗(yàn)。參考康復(fù)新液的有效濃度后，逐步探索本藥體外殺螨作用的最適濃度。不同濃度萃取液實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其中3種濃度的萃取液有100.00%殺螨效果，考慮藥物成本，萃取液的體外作用最適濃度為2%，此濃度比康復(fù)新液的有效濃度低，理論上不會(huì)對(duì)人體造成損害，故將2%萃取液用于人體面部實(shí)驗(yàn)。

2%萃取液面部殺螨效果觀察，因個(gè)體差異，用藥后的情況并不相同。在受試者面部用藥3 d后出現(xiàn)3種不同的狀況，其中4名受試者面部查蟲死亡率明顯降低，這可能是由于萃取液對(duì)面部皮膚毛囊深部螨蟲的刺激作用，使之爬出皮膚表面，而使查蟲死亡率明顯降低。用藥7 d后，有4名受試者面部查蟲出現(xiàn)陰性結(jié)果，可能是由于萃取液對(duì)這4名受試者殺螨效果明顯，死螨及時(shí)被洗掉，同時(shí)不排除萃取液對(duì)該4名受試者面部蠕形螨無(wú)刺激作用或刺激作用還未表現(xiàn)。其中2名受試者經(jīng)過7 d用藥后面部查蟲死亡率明顯降低，推測(cè)是因?yàn)閭€(gè)體差異藥物對(duì)面部蠕形螨的刺激敏感性不同所致。

美洲大蠊具有促進(jìn)組織修復(fù)、改善微循環(huán)、抗炎鎮(zhèn)痛作用〔13〕，用藥7 d后觀察受試者的面部狀況發(fā)現(xiàn)均有不同程度的好轉(zhuǎn)，其中包括毛孔縮小、皮膚彈性增加等。

4 結(jié)論

美洲大蠊萃取液對(duì)于面部蠕形螨有較好的殺蟲效果，萃取液對(duì)體外蠕形螨作用的最適濃度為2%，效果好，未見副作用，受試者的面部皮膚狀況較用藥前均有不同程度改善。本項(xiàng)目研究過程中通過多次改進(jìn)設(shè)計(jì)的“針刺給藥殺螨法”實(shí)用有效，為相關(guān)課題的研究提供了簡(jiǎn)易可行的新方法。

5 展望

20世紀(jì)70年代以來，我國(guó)科學(xué)工作者開始對(duì)美洲大蠊進(jìn)行研究，并已取得一定成果。康復(fù)新液是從昆蟲藥材提取液中分離、精制而成的生物制劑，是根據(jù)云南大理白族人民應(yīng)用美洲大蠊治療惡瘡的有效經(jīng)驗(yàn)提取而成。經(jīng)美洲大蠊醇提物純化精制而成的生物制品康復(fù)新液治療了大量在越自衛(wèi)反擊戰(zhàn)中受傷的戰(zhàn)士，顯示出其對(duì)燒傷、燙傷等外傷刨面的良好療效〔14-16〕。目前尚未見美洲大蠊萃取液針對(duì)人體面部蠕形螨作用的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)證明用美洲大蠊萃取液治療人體面部蠕形螨感染具有很大的研發(fā)前景。本課題組接受來自云南騰藥制藥股份有限公司的委托，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可由實(shí)驗(yàn)室理論研究轉(zhuǎn)化為藥用物品，具有極高的商業(yè)價(jià)值和科研轉(zhuǎn)化效益。隨著人們對(duì)蠕形螨病的治療需求日益增加，治療蠕形螨引起的肌膚問題也逐漸成為科學(xué)工作者研究的方向，本次試驗(yàn)為解決面部蠕形螨問題提供了新的方法。

“針刺給藥殺螨法”是本實(shí)驗(yàn)自創(chuàng)方法，操作簡(jiǎn)便，在本實(shí)驗(yàn)過程中證實(shí)其有效性及可行性，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)涉及透明膠帶取材的研究提供新的實(shí)驗(yàn)方法。