美洲大蠊提取物對博來霉素致大鼠肺纖維化的影響

楊永壽，何正春，肖培云

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理 671000）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）一直是困擾人類的頑疾，癥狀主要表現為運動性呼吸困難、干咳等，是以彌漫性的肺泡炎、肺間質炎癥和間質纖維化為組織學特點的一組疾病群，至今尚無可逆轉肺纖維化的藥物〔1〕。目前臨床上多選用腎上腺皮質激素、干擾素、秋水仙堿等藥物進行長期治療，但這些藥物副作用大，且不能有效阻止肺纖維化的進一步發展〔2〕，一旦染上，終身不愈，最終導致肺部功能喪失，活活憋死，給患者和家屬造成極大的身心困擾和經濟負擔〔3-4〕。因此，尋找能更好治療、延緩肺纖維化病程的藥物和治療方法，最大限度減輕病人痛苦和經濟負擔，提高其生活質量是目前醫藥工作者急需研究的課題。

美洲大蠊（Periplaneta americana）為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬干燥蟲體，始載于《神農本草經》〔5〕，研究表明美洲大蠊提取物具有清除自由基和抑制脂質過氧化的作用〔6-7〕，過氧化反應能促進纖維化性疾病的發展，故美洲大蠊有望通過抑制機體過氧化反應達到抑制肺纖維化的目的。前期體外實驗研究發現，美洲大蠊抗肺纖維化活性提取物（ML-HB）能顯著抑制人胚肺成纖維細胞（HEL）生長〔8-9〕。本實驗擬在前期研究的基礎上，通過博來霉素（BLM）復制大鼠肺纖維化模型，研究ML-HB對BLM致大鼠肺纖維化的干預作用，為美洲大蠊抗肺纖維化的研究打下基礎。

1 材料

1.1動物清潔級SD大鼠，雄性，體質量180～200 g（購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2013-0004，批號：20160911），自由采食和飲水，飼養環境符合GB 14952—2010《實驗動物環境及設施》有關無特定病原體級的要求。

1.2試劑注射用鹽酸博來霉素（以效價計15 mg∕支，Bleomycin，BLM，日本化藥株式會社產品，批號：Y50512）；ELISA試劑盒（大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α），欣博盛生物科技有限公司，批號：R160729-102a；大鼠轉化生長因子-β1（TGF-β1），欣博盛生物科技有限公司，批號：R160831-107a）；鼠抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體（英國abcam公司）；兔抗Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）多克隆抗體（英國abcam公司）；戊巴比妥鈉（德國 Sigma公司）；ML-HB（實驗室自制，凍干粉）。

1.3儀器RHYⅢ組織切片機（江蘇常州中威電子儀器有限公司）；BMJ-Ⅲ組織包埋機（江蘇常州中威電子儀器有限公司）；PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀（江蘇常州中威電子儀器有限公司）；ASP-300S自動脫水機（德國Leica公司）；CKX41SF倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；SN255939型連續波長酶標儀（美國BioTek公司）。

2 方法

2.1分組與給藥隨機將SD大鼠分為模型組、ML-HB組、正常對照組，每組40只，造模24 h后腹腔注射給藥，ML-HB組腹腔注射60 mg∕kg的ML-HB溶液，1次∕d（給藥計量參考前期預實驗），模型組給等體積的0.9%氯化鈉溶液，正常對照組正常飼養。

2.2模型制備腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠（0.2 mL∕100 g），仰臥手術臺，固定大鼠頭部及四肢，于頸部正中脫去毛發，常規消毒后，用手術剪剪開頸部皮膚，手術刀頸正中切口，分離頸部兩側肌肉，暴露出氣管，用1 mL注射器刺入大鼠氣管軟骨環間隙，迅速注入博來霉素溶液（5 mg∕kg）。正常對照組大鼠相同條件下注入等體積0.9%氯化鈉溶液。藥物注入后立即將大鼠直立，有頻率地輕揉大鼠胸部，使藥液充分擴散，縫合、消毒，將大鼠以仰臥位放置于籠中，保持呼吸順暢，清醒后于清潔級動物房常規飼養〔10〕。

2.3取材及肺指數計算連續給藥第30、45、60、75天時各處死10只大鼠，取肺用0.9%氯化鈉溶液洗凈，吸水紙吸干并稱重。按下式計算肺指數，取左肺固定于10%中性甲醛溶液中，精密稱取右肺0.4 g，制成10%肺組織勻漿液，離心取上清，-80℃保存備用。ELISA法檢測勻漿液中的TNF-α和TGF-β1含量，按試劑盒說明書操作測定。

2.4病理標本制備將左肺組織從10%中性甲醛溶液中取出，取相同部位用石蠟包埋，制作厚度5 m切片，免疫組化染色觀察肺組織中α-SMA與ColⅠ的表達。

2.5統計學分析用SPSS 17.0軟件進行統計分析，結果以（）表示，數據采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 ML-HB對肺指數的影響給藥4個時間點各組大鼠肺指數測定結果見表1。與正常對照組相比，模型組肺指數均升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，ML-HB組肺指數均降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 ML-HB對大鼠肺指數的影響（，n=10）

表1 ML-HB對大鼠肺指數的影響（，n=10）

注：與正常對照組相比**P＜0.01；與模型組相比△P＜0.05。

組別正常對照組模型組ML-HB組第30天0.582 6±0.035 9 1.018 5±0.128 0**0.871 3±0.254 2△第45天0.529 9±0.048 6 1.159 6±0.150 4**0.986 9±0.158 8△第60天0.653 0±0.102 2 1.123 1±0.355 8**0.831 3±0.105 6△第75天0.517 6±0.074 7 0.956 6±0.143 4**0.791 6±0.128 4△

3.2 ML-HB對TNF-α的影響給藥4個時間點，與正常對照組相比，模型組肺組織中TNF-α含量顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，給藥第30、45天時，ML-HB組肺組織中TNF-α含量顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.01），第60、75天時，ML-HB組肺組織中TNF-α含量亦降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

3.3 ML-HB對TGF-β1的影響給藥4個時間點，模型組較正常對照組大鼠肺組織中TGF-β1含量顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；ML-HB組TGF-β1含量顯著低于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表3。

表2 ML-HB對大鼠肺組織中TNF-α的影響（，n=10，ng∕mL）

表2 ML-HB對大鼠肺組織中TNF-α的影響（，n=10，ng∕mL）

注：與正常對照組相比**P＜0.01；與模型組相比△P＜0.05，△△P＜0.01。

第75天0.283 2±0.047 8 0.451 5±0.165 4**0.305 4±0.062 1△組別正常對照組模型組ML-HB組第30天0.352 8±0.094 1 0.659 8±0.101 5**0.456 2±0.098 5△△第45天0.389 2±0.073 5 0.714 5±0.097 0**0.435 4±0.067 6△△第60天0.297 7±0.059 4 0.531 0±0.098 3**0.394 2±0.081 9△

表3 ML-HB對大鼠肺組織中TGF-β1的影響（，n=10，ng∕mL）

表3 ML-HB對大鼠肺組織中TGF-β1的影響（，n=10，ng∕mL）

注：與正常對照組相比**P＜0.01；與模型組相比△△P＜0.01。

組別正常對照組模型組ML-HB組第30天2.061 8±0.778 4 4.888 3±1.830 7**2.825 6±1.352 4△△第45天1.974 3±0.541 5 4.554 9±0.728 9**2.806 2±1.115 3△△第60天2.301 2±1.367 1 4.631 8±1.036 8**2.843 9±1.271 2△△第75天2.188 3±0.353 9 4.690 3±1.346 6**2.836 1±0.948 3△△

3.4免疫組化染色法觀察ML-HB對大鼠肺組織α-SMA和ColⅠ的影響

3.4.1 ML-HB對α-SMA的影響 給藥4個時間點，正常對照組肺泡結構正常，隨時間的延長有少量α-SMA表達。模型組第30、45天時支氣管周圍、血管周圍及肺泡間隔有大量的呈棕黃色強陽表達，表明有大量的肌成纖維化細胞存在，肺纖維化嚴重，第60天時有大量肺間質細胞增生遷移，形成的纖維細胞灶引起肺纖維化，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）大量沉積，造成α-SMA呈強陽性表達，第75天時α-SMA聚集成團，呈強陽性表達，肺纖維化更加嚴重。ML-HB組第30天時棕黃色顏色較少較淺，未見細胞間隙液有明顯的α-SMA陽性表達，第45天時細胞間隙液有較弱的α-SMA陽性表達，第60、75天時α-SMA的表達部位主要集中在氣管或支氣管周圍，未見ECM有強陽性表達，與模型組相比，ML-HB組4個時間點肺組織中的陽性表達明顯較低。見圖1。

3.4.2 ML-HB對ColⅠ的影響 正常對照組在用藥期內肺泡結構正常，只有少量的ColⅠ表達。模型組第30、45天時肺間質及ECM中可見呈藍色ColⅠ的陽性表達，第60天時幾乎沒有正常的肺泡組織，肺實變嚴重，有大量纖維細胞灶，ColⅠ呈強陽性表達，第75天時有聚集成團的纖維性細胞，肺實變嚴重，ColⅠ也呈強陽性表達。與模型組相比，第30天時在ML-HB組肺組織的ECM未見ColⅠ大量沉積，藍色染色較淺較少，第45、60、75天時ColⅠ在ML-HB組肺組織中的表達明顯低于模型組。見圖2。

4 討論

肺纖維化的形成是機體過度修復的結果，當致病因素作用于機體導致肺組織受損傷時，肺組織內的成纖維細胞在炎癥細胞和炎癥因子的作用下會出現表型轉化，轉化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞可通過分泌膠原、纖維連接蛋白等物質，使病灶局部形成疤痕，從而維持肺泡結構和功能的完整〔11〕。當致病因子持續作用于機體引起肺泡上皮細胞持續損傷，分泌TNF-α、TGF-β1等細胞因子，這些細胞因子可以促進肺泡上皮細胞間質轉化，形成成纖維細胞及肌成纖維細胞，導致膠原纖維大量沉積〔12〕。

由表1可知，在用藥期間模型組大鼠肺指數顯著高于正常對照組，表明肺水腫較嚴重，經ML-HB治療后肺指數降低。由表2可知，各時間點ML-HB組中TNF-α的含量低于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.05），表明ML-HB對肺組織中TNF-α的表達有較強的干預作用。TNF-α是一種前炎癥細胞因子，能刺激中性粒細胞及嗜酸性細胞產生超氧化物，釋放溶酶體酶，對于周圍細胞產生毒性作用〔13〕，同時介導其他細胞因子和炎癥因子的表達，增強損傷肺炎癥細胞浸潤，介導肺泡炎癥反應，并刺激成纖維細胞增殖，促進膠原合成〔14〕。實驗結果表明，ML-HB具有抑制TNF-α表達，從而抑制炎癥進一步發展的作用。

大量研究證實TGF-β1可誘導肺成纖維細胞增殖、并向肌成纖維細胞轉化，刺激成纖維細胞合成大量I、III型膠原，同時可抑制膠原酶和纖溶酶的合成，導致膠原降解減少，ECM在肺間質中大量形成，導致纖維化〔15-16〕。由表3可知，ML-HB具有抑制肺纖維化模型大鼠肺組織中TGF-β1的表達，從而起到延緩肺纖維化進一步發展的作用。

α-SMA是肺成纖維細胞轉化成肌成纖維細胞的標志，肌成纖維細胞可持續分泌纖連蛋白、蛋白多糖、層黏連蛋白和膠原等ECM〔17〕，分泌各種生長因子、炎癥介質、趨化因子〔18〕，還能通過分泌基質金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制因子調控膠原的合成和代謝〔19〕，因此肌成纖維細胞轉化是導致肺纖維化最為重要和關鍵的步驟。在正常的肺組織中，ECM的合成與分解代謝處于動態平衡，有助于維持肺組織的正常結構與呼吸功能。α-SMA和ColⅠ是ECM的主要成分，是由肺成纖維細胞和轉型后的肌纖維母細胞合成和分泌，其過度蓄積是PF的特征性病理改變〔20〕。本實驗用免疫組化法檢測α-SMA、ColⅠ在大鼠肺組織中的表達，直觀地觀察ML-HB對纖維化大鼠肺組織中肌成纖維細胞的影響，結果顯示隨著造模時間的延長，α-SMA、ColⅠ在模型組肺組織中的表達逐漸增多，肺纖維化初期就呈強陽性表達。與模型組相比，隨著給藥時間的延長，ML-HB組α-SMA、ColⅠ的表達明顯降低，表明ML-HB可能通過調控α-SMA、ColⅠ在肺組織中的表達，抑制肌成纖維細胞的活化增殖、ECM沉積，從而達到干擾肺纖維化的作用。

研究結果表明，ML-HB能抑制TNF-α、TGF-β1、α-SMA、ColⅠ的表達，其作用機制可能是抑制了炎癥細胞浸潤及巨噬細胞在肺泡附近的增殖和聚集，降低肌成纖維細胞的增殖及ECM沉積，從而達到減緩肺纖維化的作用。肺纖維化的形成是一個復雜的過程，其對TNF-α、TGF-β1、α-SMA、ColⅠ等相關因子的調控作用有待進一步研究。