基于活血功效的云南鼠尾草最佳提取工藝研究

張彥如，白 雪，曹 波，林雅雯，張海珠*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000；2.成都中醫藥大學藥學院，成都 611137）

云南鼠尾草（Salvia yunnanensisC.H.Wright）是唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，又名小丹參、紫丹參、小紅草烏、小紅黨參，主要分布于我國西南地區，其根入藥，有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰等功效〔1〕。云南鼠尾草有著悠久的藥用歷史，明代《滇南本草》曾記載：“一味可抵四物湯補血之功”，民間主要將其用于治療婦科和骨傷疾病等〔2〕。現代藥理實驗研究表明，云南鼠尾草具有廣泛的生物活性，能抑制和解除血小板聚集，改善微動脈、微靜脈痙攣和血液流態，防止血栓形成，改善微循環障礙，對血管重塑具有調節作用，增加心肌供氧量的同時還可以降低需氧量〔3〕；具有抗肝炎、抗病毒和抗腫瘤等活性〔4〕。隨著現代藥理作用的深入研究，云南鼠尾草日益受到重視，市場需求日益增大。

目前鼠尾草屬藥用植物的提取方法主要是以某一有效成分為指標，如丹參酮ⅡA、丹酚酸B〔5-7〕，通過多次加熱回流獲得提取物〔8〕。該方法評價指標單一，僅從化學角度確定中藥的提取工藝或進行質量評價，無法密切關聯臨床功效和活性〔9-10〕。有研究表明云南鼠尾草活血功效優于丹參，體內、體外均能顯著抑制血小板聚集〔2〕，因此本研究針對其活血的功效指標來評價云南鼠尾草的最佳提取工藝，彌補了僅僅采用化學成分檢測的不足，以期為鼠尾草屬藥用植物的深度開發應用提供基礎實驗室數據。

1 材料

1.1藥材與試劑云南鼠尾草經大理大學段寶忠教授鑒定為唇形科植物云南鼠尾草（Salvia yunnanensisC.H.Wright）（產自云南大理，粉粹過20目篩）；甲醇（分析純，四川西隴科學有限公司）；水合氯醛（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180305）；二磷酸腺苷（ADP，分析純，北京索萊寶科技有限公司，批號：716E021）；二甲基亞砜（DMSO，分析純，富宇精細化工有限公司，批號：821D0311）；0.9%氯化鈉溶液（石家莊四藥有限公司，批號：2001173203）。

1.2實驗動物SPF級健康雄性SD大鼠，體質量200～220 g，購買自長沙市天勤生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2014-0011。正式實驗前，動物適應性飼養1周，飼養環境為常規日夜周期，溫度（21±2）℃，濕度40%～45%，自由進食飲水。

1.3儀器AggRAM血小板凝集儀（美國海倫娜公司）；SK5210HP型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；TGL-18C飛鴿臺式離心機（上海安亭飛鴿儀器有限公司）；RQ∕ZC真空采血管（成都瑞琦科技實業股份有限公司）；LGJ-50F冷凍干燥機（廣州市星爍儀器有限公司）。

2 方法

2.1樣品制備云南鼠尾草藥材在60℃烘箱中干燥6 h至恒重，粉粹后過20目篩。準確稱量3.000 g藥材細粉按L9（34）正交試驗設計方案進行超聲提取，提取液經真空冷凍干燥為粉末，依次命名為E1～E9。準確稱量不同凍干粉0.100 g，用含5%DMSO的0.9%氯化鈉溶液500 μL超聲溶解，配制成濃度為200 mg∕mL的生藥原液。每種生藥原液按照1：0.7劑距稀釋分別得6個梯度濃度用于后續檢測體外抗血小板聚集能力。測定前用0.45 μm濾膜過濾，續濾液即為待測樣品溶液。正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2.2富血小板血漿（PRP）和貧血小板血漿（PPP）的制備健康雄性SD大鼠，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL∕100 g）進行麻醉，腹主動脈取血，以0.13 mol∕L枸櫞酸鈉1：9抗凝。800 r∕min離心10 min，取上清液后，沉淀部分以相同條件再次離心，合并2次上清液得到 PRP；剩余部分以 3 500 r∕min 離心 15 min，吸取上清液即為PPP。PRP和PPP需要保持在18～25℃條件下，以PPP調節PRP的血小板濃度至4×108個∕mL〔11-13〕。

2.3體外抗血小板聚集試驗取用PPP 300 μL進行透光度調零，精密量取PRP 250 μL于測試杯中，然后分別精密加入25 μL待測樣品溶液，放入磁珠攪拌均勻，預熱通道內37℃溫育3 min，之后再將測

試杯放入調零后的檢測通道，準確加入25 μL ADP（0.256 mg∕mL），記錄最大血小板聚集率和血小板聚集曲線，每組平行測定2次，應在血液采集后2 h內完成檢測，以含5%DMSO的0.9%氯化鈉溶液作為對照溶液測定空白血漿的最大聚集率。

2.4數據處理血小板聚集抑制率計算公式〔14〕如下：

正交試驗數據采用SPSS 20.0統計軟件進行方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義，實驗數據取2次獨立實驗數據的平均值。使用GraphPad Prism 6.01軟件處理抗血小板聚集實驗數據，并繪制濃度-抑制率曲線。

3 結果

3.1方法學考察結果

3.1.1 穩定性考察 取同一待測樣品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h按“2.3”項測定其最大血小板聚集率，計算RSD。最大血小板聚集率RSD為2.50%，表明待測樣品溶液在24 h內穩定性良好。

3.1.2 重復性考察 取同一待測樣品溶液6份，在“2.3”項條件下分別測定，平行測定2次，記錄樣品溶液的最大血小板聚集率，計算得RSD為2.36%，說明該試驗方法具有良好的重復性。

3.1.3 精密度考察 取同一待測樣品溶液，在“2.3”項條件下連續測定6次，記錄最大血小板聚集率，計算RSD，RSD值為1.64%，表明儀器的精密度良好。

3.2云南鼠尾草體外抗血小板聚集作用由圖1可明顯看出，9種不同提取工藝所得云南鼠尾草提取物對體外ADP誘導的血小板聚集均有抑制作用，且抑制率與提取物濃度呈正相關；E4對血小板聚集作用的抑制率最高，其余依次為E3、E8、E7、E6、E2、E9、E5，抑制血小板聚集作用最弱的是E1。不同工藝提取物濃度與抑制率的二次曲線回歸方程見表2。最佳半數有效濃度（EC50）值越小，提取物抗血小板聚集作用對應的藥液濃度越低，抗血小板聚集效率越高。因此，可以根據抑制曲線的線性關系和EC50值來評價不同提取物抗血小板聚集作用的效果。

表2 血小板抑制率曲線二次回歸擬合

3.3正交試驗結果根據前期試驗資料，選取料液比、甲醇濃度、提取時間及提取次數4個因素進行L9（34）正交試驗，確定從云南鼠尾草中提取發揮活血功效化學成分的最佳超聲提取條件，結果見表3，方差分析見表4。

由表3分析可知，甲醇濃度的極差最大（19.006），說明甲醇濃度對云南鼠尾草中發揮活血功效化學成分的提取影響最大，其次是提取次數、料液比，最后是提取時間。試驗結果表明，各因素影響程度大小為甲醇濃度（D）＞提取次數（A）＞料液比（C）＞提取時間（B）。由表4中P值可知，因素D對提取效果具有顯著影響（P＜0.05），而因素A、B、C無顯著影響（P＞0.05）。結合云南鼠尾草體外抗血小板聚集作用結果，E4的血小板聚集作用抑制率最高，故云南鼠尾草中活血功效化學成分的最佳提取條件是A2B1C2D3，即料液比1：15、甲醇濃度100%、提取時間30 min、提取次數2次。在此條件下，測得體外ADP誘導抗血小板聚集的EC50為4.141 mg∕mL。

表3 L9（34）正交試驗設計方案及結果

表4 正交試驗方差分析

4 討論

云南鼠尾草主要分布于云南、貴州、四川等地，在西南地區有近600年的藥用歷史，其味苦、微寒，《紅河中草藥》中記載：“活血行瘀，調經止痛”，是彝族、苗族、白族等少數民族常用藥材〔15〕。雖然云南鼠尾草未被《中國藥典》收載，但已被云南、貴州等省中藥材部頒標準所收載，目前市場上以云南鼠尾草為原料的藥品主要有丹莪婦康煎膏、紫燈膠囊、紫丹活血片、銀丹心泰滴丸、龍金通淋膠囊等。其相關的單方和成方制劑在婦科、心系、骨傷和血瘀腫痛等領域廣泛應用〔2〕，具有良好的民間臨床應用經驗和基礎，鑒于此應進一步加強其物質基礎與藥效間的相關研究，促進云南鼠尾草的資源利用和產品開發，使其更好地服務于人類。

中藥化學成分復雜，作用機制不明確，具有多成分、多途徑、多靶點協同作用的特點。現有的提取工藝方法多數以指標性成分的含量測定為主，根據某一個或幾個化學成分含量的多少來評判提取方法的優劣。例如，大黃藥材的提取工藝研究中以總游離蒽醌〔16〕、大黃酸〔17〕、番瀉苷 A〔18〕等含量來確定最佳提取工藝，其中總游離蒽醌與大黃瀉下通便的功效幾無關聯，且與大黃利濕退黃、清熱瀉火的功效關系也不明確，因此單一指標性成分的定量分析難以實現對中藥材提取工藝全面客觀的評價。

目前從云南鼠尾草中共分離鑒定了85種化合物，主要化學成分為脂溶性菲醌化合物和水溶性酚酸類化合物〔19〕。云南鼠尾草中發揮活血功效的成分有丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、丹參素、迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、異阿魏酸等〔20〕，顯然僅以單一成分為指標研究云南鼠尾草的提取工藝存在明顯不足。因此本研究以活血功效為指征，緊密結合臨床療效，從整體活血成分群考察云南鼠尾草的最佳提取工藝。

由于實驗條件有限，未開展云南鼠尾草中發揮活血功效的活性成分及其抗血小板聚集作用強弱研究。因此，課題延續工作將圍繞建立系統方法考察云南鼠尾草中活性成分的抗血小板作用機制，為進一步篩選出高療效、低副作用、高生物利用度的活血化瘀藥物奠定基礎。