溫潤通絡(luò)法對糖尿病模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用*

河北中醫(yī)學(xué)院

王 迪 薛思思 姚曉光 楊亦楠 成秀梅 劉 斌△(石家莊 050200)

提要 目的：研究溫潤通絡(luò)方對糖尿病(DM)模型大鼠坐骨神經(jīng)電生理及坐骨神經(jīng)組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)的影響，探討溫潤通絡(luò)法對糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)的神經(jīng)保護(hù)作用及其部分作用機(jī)理。方法：實驗動物隨機(jī)分為空白組、模型組、溫潤通絡(luò)方高、低劑量組、血府逐瘀湯組。采用鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法建立大鼠DM模型，觀察大鼠一般狀態(tài)和坐骨神經(jīng)形態(tài)功能變化，采用熒光分光光度法、比色法和化學(xué)法測定醛糖還原酶(AR)活性、Na+-K+-ATP酶和山梨醇(SNS)的表達(dá)情況。免疫組化法檢測坐骨神經(jīng)及其周圍組織VEGF、bFGF表達(dá)。結(jié)果：與空白組相比，模型組坐骨神經(jīng)病變表現(xiàn)為神經(jīng)纖維腫脹，鞘細(xì)胞減少，神經(jīng)外膜毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，炎細(xì)胞浸潤；模型組大鼠坐骨神經(jīng)AR活性和SNS含量顯著升高(P<0.01)，Na+-K+-ATP酶活性顯著降低(P<0.01)；坐骨神經(jīng)及其周圍組織中VEGF、bFGF表達(dá)顯著升高(P<0.01)；經(jīng)藥物治療后，與模型組比較，溫潤通絡(luò)方高劑量組大鼠坐骨神經(jīng)AR活性和SNS含量顯著降低(P<0.01)，Na+-K+-ATP酶活性升高(P<0.01)，各藥物組坐骨神經(jīng)組織VEGF、bFGF表達(dá)均降低(P<0.01)，各中藥干預(yù)組中，溫潤通絡(luò)方高劑量組降低最為顯著。結(jié)論：溫潤通絡(luò)方不僅降低DM大鼠坐骨神經(jīng)AR和SNS含量、提高Na+-K+-ATP酶活性，還可促進(jìn)坐骨神經(jīng)及其周圍組織中的VEGF、bFGF表達(dá)，說明溫潤通絡(luò)法可通過加強(qiáng)對周圍神經(jīng)功能的保護(hù)作用而達(dá)到改善坐骨神經(jīng)病變，治療DPN的作用。

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是糖尿病(DM)中的一種最常見的慢性并發(fā)癥，臨床患病率高，也是引起DM患者致殘的常見原因[1]，病變累及感覺、運(yùn)動和自主神經(jīng)及其周圍肌肉組織，主要表現(xiàn)為下肢較為多見的肢體對稱性疼痛和感覺異常以及周圍神經(jīng)功能障礙相關(guān)的癥狀。[2]近年來，課題組根據(jù)DPN氣陰兩虛、痰瘀阻滯的病機(jī)特點，采用溫潤通絡(luò)方治療DPN取得了較好的臨床療效，然而其對神經(jīng)組織的保護(hù)作用機(jī)理尚未明確?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要與糖代謝異常引起微血管病變，從而導(dǎo)致神經(jīng)組織代謝紊亂等多種因素有關(guān)。[3]本實驗旨在研究溫潤通絡(luò)方對DM大鼠坐骨神經(jīng)組織中糖代謝以及血管損傷的影響，觀察溫潤通絡(luò)方對DPN的神經(jīng)保護(hù)作用，并探討其部分作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 采用清潔級健康SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(許可證號：SCXK冀2003-1-003)，實驗動物飼養(yǎng)于清潔級動物實驗室，飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度20℃～24℃，濕度45%～55%，光照12 h左右，自由進(jìn)食飲水。

1.2 藥物及制備 溫潤通絡(luò)方[4]水煎劑，藥物組成：桂枝、生地黃、女貞子、旱蓮草、仙靈脾、白芍等。組成藥物均購于石家莊樂仁堂藥店，由河北中醫(yī)學(xué)院中藥制劑室制備并鑒定，煎煮方法即藥物浸泡30 min后用文火煎煮20 min，取汁加水復(fù)煎，去渣、過濾、濃縮后，溫潤通絡(luò)方高劑量組制成生藥濃度為3.4 g/mL以及低劑量組1.7 g/mL的半液體，置冰箱4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

血府逐瘀湯水煎劑，藥物組成：桃仁12 g，紅花、當(dāng)歸、生地黃、牛膝各9 g，川芎、桔梗各4.5 g，赤芍、枳殼、甘草各6 g，柴胡3 g。制備方法同上，最后濃縮成含生藥濃度為2.56 g/mL的灌胃藥液，置冰箱備用。

1.3 主要儀器和試劑

1.3.1 主要儀器設(shè)備：光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS；Neofuge-15R高速冷凍離心機(jī)，香港力康生物科技有限公司；EG11508組織包埋機(jī)、RM2245石蠟切片機(jī)，德國Leica公司；Hymalyzer2000型半自動生化分析儀，德國豪邁公司；930型熒光分光光度計，上海第三分析儀器廠。

1.3.2 主要試劑：鏈脈佐菌素(STZ)，購自美國Sigma公司；Na+-K+-ATP酶試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；測血糖試劑，購自保定長城臨床試劑有限公司；血管內(nèi)皮生長因子(SC-7269)鼠抗IgG單抗、堿性成纖維生長因子(SC-79)兔抗IgG多抗，均購自Santa Cruz公司。

2 實驗方法

2.1 動物分組及處理 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，實驗動物隨機(jī)分為空白組、模型組、溫潤通絡(luò)方高劑量組、溫潤通絡(luò)方低劑量組、血府逐瘀湯組，共5組，每組12只。除空白組外其余各組參考Schmeichel等的采用STZ腹腔注射的方法建立大鼠DPN模型，即大鼠禁食不禁水12 h后，按50 mg/kg給藥劑量一次性腹腔內(nèi)注射1%STZ枸櫞酸緩沖液，72 h后測大鼠尾尖血糖≥16.7 mmol/L即造模成功，空白組則注射相同體積的枸櫞酸緩沖液。

各中藥組分別采用溫潤通絡(luò)方34.0 g/kg·d-1、17.0 g/kg·d-1(為成人臨床用藥的20、10倍)以及血府逐瘀湯12.8 g/kg·d-1(為成人臨床用藥的10倍)的劑量進(jìn)行灌胃，1次/d，共8周?？瞻捉M和模型組等體積0.9%生理鹽水灌胃。8周末后取材，禁食不禁水24 h，10%水合氯醛(200 mg/kg)麻醉大鼠，斷頭取血并分離血清存于-20℃，取坐骨神經(jīng)及其周圍組織部分固定于4%多聚甲醛溶液，部分則保存于-80℃待測。

2.2 大鼠一般狀態(tài)和血糖檢測 觀察各組大鼠一般狀態(tài)如毛色、形態(tài)、飲水量、進(jìn)食量、尿量、行為活動等，并采用葡葡糖氧化酶法測定血糖。

2.3 大鼠坐骨神經(jīng)及其周圍組織HE染色 將坐骨神經(jīng)組織石蠟包埋并切片后，依次放入二甲苯、無水乙醇、梯度酒精溶液中脫蠟至水，蒸餾水沖洗；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，1%鹽酸-乙醇溶液進(jìn)行分化，自來水返藍(lán)；伊紅染細(xì)胞質(zhì)；切片依次放入梯度酒精和無水乙醇、二甲苯溶液中脫水透明并封片，顯微鏡鏡檢并進(jìn)行圖像采集。

2.4 檢測大鼠坐骨神經(jīng)組織中醛糖還原酶(AR)、Na+-K+-ATP酶、山梨醇(SNS)含量 采用熒光分光光度法檢測AR活性，比色法檢測Na+-K+-ATP酶、化學(xué)法檢測SNS含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。由坐骨神經(jīng)組織勻漿作為樣本，取100 mg坐骨神經(jīng)組織，清洗后濾干放入1.5 mL離心管并置于冰上，加入1 mL 1×PBS用超聲研磨器中研磨，制成勻漿，-20℃過夜后反復(fù)凍融2～3次以破壞細(xì)胞膜，于4℃，5 000 r/min離心10 min取上清液即可實驗。

2.5 免疫組化法檢測大鼠坐骨神經(jīng)及其周圍組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)蛋白的表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)染色(SP)的方法檢測大鼠卵巢及子宮組織中VEGF、bFGF的蛋白分布和表達(dá)：⑴石蠟切片脫蠟至水；⑵切片置于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液，微波抗原修復(fù)，PBS洗；⑶滴加3%雙氧水溶液，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，37℃避光孵育15 min，PBS洗；⑷山羊血清37℃封閉20 min；⑸滴加一抗(抗體稀釋比例為1:2 000)4℃孵育過夜；⑹PBS洗，滴加HRP標(biāo)記的二室溫孵育50 min；⑺PBS洗，滴加DAB顯色液，光鏡觀察，當(dāng)陽性表達(dá)為棕黃色終止顯色；⑻蘇木素復(fù)染1～2 min，1%鹽酸-酒精分化，自來水洗；⑼切片脫水透明，中性樹膠封片；⑽顯微鏡鏡檢，Image J軟件分析各組光密度值。

3 實驗結(jié)果

3.1 大鼠一般狀態(tài)和血糖測定 造模期間，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)毛發(fā)無澤、行動遲緩、精神萎靡的狀態(tài)，不僅較空白組飲食量增加，且出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、尿量增加、糞便稀軟等癥狀；各治療組大鼠的“三多”癥狀較模型組輕，體質(zhì)量增加，活動和反應(yīng)情況均有不同程度的改善，其中以高劑量組癥狀減輕最為明顯，治療效果最好。此外，與空白組相比，模型組大鼠血糖升高明顯(P<0.01)；與模型組相比，血府逐瘀湯組血糖下降不明顯，差異無顯著性(P>0.05)，溫潤通絡(luò)方高、低劑量組大鼠血糖均顯著下降(P<0.01)，其中以溫潤通絡(luò)方高劑量組血糖最低。與溫潤通絡(luò)方高劑量組比較，血府逐瘀湯組和溫潤通絡(luò)方低劑量組血糖明顯較高(P<0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠血糖變化

3.2 大鼠坐骨神經(jīng)及其周圍組織病理改變 如圖1所示，正常組大鼠坐骨神經(jīng)纖維分布排列整齊，形態(tài)規(guī)整，軸突髓鞘結(jié)構(gòu)清晰完整，單個纖維飽滿，鞘壁均勻，可見到Schwann細(xì)胞核，長平型，纖維細(xì)胞核呈卵圓形。模型組大鼠與正常組比較，神經(jīng)纖維排列松散紊亂，變細(xì)，出現(xiàn)裂隙，密度不均勻，有斑塊狀密度下降，髓鞘空泡變性，Schwann細(xì)胞增殖，軸突萎縮甚至消失，毛細(xì)血管管壁增厚，管腔不規(guī)則。高劑量組大鼠表現(xiàn)為神經(jīng)纖維較規(guī)則，密度增高，有髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)接近正常，髓鞘脫落較少，髓鞘中可見正常軸突。低劑量組、對照組大鼠坐骨神經(jīng)表現(xiàn)為神經(jīng)纖維腫脹，排列松散，有脫髓鞘現(xiàn)象，軸突萎縮甚至消失。

注：A 空白組；B 模型組；C 血府逐瘀湯對照組；D 溫潤通絡(luò)方高劑量組；E 溫潤通絡(luò)方低劑量組。

3.3 大鼠坐骨神經(jīng)組織中AR、Na+-K+-ATP酶、SNS含量 與空白組相比，模型組AR和SNS含量明顯升高，Na+-K+-ATP酶活性明顯降低，差異均有非常顯著性(P<0.01)。與模型組相比，溫潤通絡(luò)方高劑量組AR明顯降低(P<0.01)，溫潤通絡(luò)方低劑量組和血府逐瘀湯組差異無顯著性(P>0.05)；各治療組Na+-K+-ATP酶活性均明顯升高、SNS含量降低，差異均有顯著性(P<0.01，P<0.05)，其中以溫潤通絡(luò)方高劑量組各項指標(biāo)改善最為顯著。詳見表2。

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織中AR、Na+-K+-ATP酶、SNS含量

3.4 大鼠坐骨神經(jīng)組織中VEGF、bFGF蛋白的表達(dá) 各組大鼠坐骨神經(jīng)及其周圍組織中VEGF、bFGF蛋白相對光密度值的比較：與空白組相比，模型組大鼠坐骨神經(jīng)組織VEGF、bFGF蛋白水平均明顯增多(P<0.01)；與模型組相比，各治療組VEGF、bFGF蛋白水平均顯著降低，差異均有非常顯著性(P<0.01)，其中以溫潤通絡(luò)方高劑量組最低；與溫潤通絡(luò)方高劑量組相比，血府逐瘀湯組、溫潤通絡(luò)方低劑量組VEGF、bFGF蛋白表達(dá)較高(P<0.05)。詳見表3、圖3、圖4。

表3 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織中VEGF、bFGF 的相對光密度值

注：A 空白組;B 模型組；C 血府逐瘀湯；D 溫潤通絡(luò)方低劑量組；E 溫潤通絡(luò)方高劑量組。

注：A 空白組；B 模型組；C 血府逐瘀湯；D 溫潤通絡(luò)方低劑量組；E 溫潤通絡(luò)方高劑量組。

4 討論

DPN確切的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚, 普遍認(rèn)為是代謝紊亂、血管損傷、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、細(xì)胞因子異常、氧化應(yīng)激和免疫等多因素均發(fā)揮作用的結(jié)果，故西醫(yī)治療通過采用降糖、醛糖還原酶抑制劑、抗氧化劑及神經(jīng)營養(yǎng)等藥物改善DPN相關(guān)癥狀。[5]而中醫(yī)藥治療DPN有其突出的特色和優(yōu)勢，通過對DPN進(jìn)行辨證分型論治，臨床療效甚佳。DPN屬中醫(yī)屬“消渴”日久而致“痹證”“痿證”范疇，本病本虛標(biāo)實，以陰陽兩虛、氣陰不足為本，以痰瘀阻絡(luò)為標(biāo)。消渴日久，導(dǎo)致氣陰不足、陰損及陽，瘀血痰濁阻痹脈絡(luò)是本病的主要病機(jī)[1]，故應(yīng)用溫陽養(yǎng)陰、化痰祛瘀通絡(luò)的溫潤通絡(luò)法治療DPN。成師在臨床上治療DPN采用溫潤通絡(luò)方，取得了很好的療效，方由桂枝、地龍、白芍、生地黃、仙靈脾、女貞子、旱蓮草等藥物組成[6]，溫而不燥、滋而不膩、活血祛瘀、化痰通絡(luò)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，溫潤通絡(luò)方可多靶點改善糖尿病周圍神經(jīng)病變，其中，桂枝具有擴(kuò)張血管，促進(jìn)血液循環(huán)，可抗醛糖還原酶活性；地龍有效成分蚓激酶可抑制血小板聚集、防止血栓形成；白芍有降糖、擴(kuò)血管、清除氧自由基、免疫雙向調(diào)節(jié)等作用；生地黃有降低血糖、強(qiáng)心、止血等作用；仙靈脾改善微循環(huán)，增加血流量，降低外周阻力作用；女貞子通常與旱蓮草同用，能降血脂、降血糖及抗動脈硬化。[7-10]本實驗中，鏈脲佐菌素腹腔注射建立了糖尿病大鼠模型并成功誘導(dǎo)DPN的形成。溫潤通絡(luò)方高劑量組較模型組大鼠一般癥狀明顯好轉(zhuǎn)，血糖下降，軸突萎縮變性等坐骨神經(jīng)病變明顯減輕，均說明溫潤通絡(luò)方對DM大鼠坐骨神經(jīng)病變的修復(fù)作用明顯。

DPN的發(fā)病與糖代謝引起的神經(jīng)細(xì)胞代謝異常關(guān)系密切，其機(jī)制與多元醇代謝增強(qiáng)有關(guān)。AR是多元醇代謝的關(guān)鍵酶，高血糖使其活性增高，通過激活多元醇通路使細(xì)胞內(nèi)SNS生成蓄積，繼而神經(jīng)纖維滲透壓上升，Na+-K+-ATP酶活性下降，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞代謝與功能損害, 最終引發(fā)神經(jīng)纖維病理性損傷，[11-12]如周圍神經(jīng)節(jié)段性脫髓鞘、軸突變性壞死，血管和神經(jīng)細(xì)胞功能障礙及組織結(jié)構(gòu)改變，最終參與DPN的發(fā)生和發(fā)展。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠AR和SNS含量升高，Na+-K+-ATP酶活性降低，DPN出現(xiàn)多元醇代謝紊亂；經(jīng)溫潤通絡(luò)方治療，AR、SNS含量降低，Na+-K+-ATP酶活性升高，說明溫潤通絡(luò)法可通過改善神經(jīng)細(xì)胞多元醇代謝紊亂，緩解局部癥狀。

神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFs)由組織和膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一類能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活、生長、分化的蛋白質(zhì)因子，有多種生物學(xué)效應(yīng)，目前認(rèn)為其合成、分泌、代謝障礙均參與DPN的發(fā)病機(jī)制。[13-14]在神經(jīng)祖細(xì)胞發(fā)育成神經(jīng)元的過程中, bFGF參與神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖和最初分化，[15]神經(jīng)元釋放到靶組織中的神經(jīng)生長因子(NGF)，通過bFGF而誘導(dǎo)NGF與受體結(jié)合后，通過軸索逆向轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞體，可減少神經(jīng)變性、刺激軸突生長，抑制神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)再生和修復(fù)。[16-17]故內(nèi)源性bFGF表達(dá)增多是外周神經(jīng)損傷后的早期的修復(fù)反應(yīng)，本研究中模型大鼠bFGF代償性增多，說明此時神經(jīng)細(xì)胞已發(fā)生損傷，溫潤通絡(luò)方能下調(diào)bFGF蛋白在坐骨神經(jīng)中的表達(dá)，說明溫潤通絡(luò)法可減輕bFGF代償性增多的現(xiàn)象。

此外，有研究表明，VEGF亦被認(rèn)為是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子。[18]作為促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂因子，有促軸突延伸、增加神經(jīng)元、雪旺氏細(xì)胞存活率、促進(jìn)神經(jīng)再生、神經(jīng)內(nèi)血管形成等神經(jīng)保護(hù)作用。生理條件下，VEGF在正常成熟神經(jīng)組織中不表達(dá)或少表達(dá)；然而，在缺血、缺氧、外傷、神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘及代謝異常等病理情況下，神經(jīng)組織VEGF及其受體表達(dá)顯著增高。在本實驗研究中，DPN大鼠坐骨神經(jīng)纖維中VEGF蛋白表達(dá)出現(xiàn)代償性增加，筆者的研究和以往的報道結(jié)果一致，[19]說明VEGF可在高糖環(huán)境下，發(fā)揮營養(yǎng)因子的保護(hù)作用；經(jīng)溫潤通絡(luò)方治療后，VEGF蛋白表達(dá)較模型組降低，說明溫潤通絡(luò)法對神經(jīng)組織有一定保護(hù)作用。

DPN發(fā)于消渴，其發(fā)生發(fā)展與肝、脾、腎三臟關(guān)系密切，陰虛燥熱是消渴的基本病機(jī)；消渴日久，燥熱灼津為痰；痰阻脈絡(luò)、陰損及陽，陽氣不能溫煦四末，氣不行血，血瘀脈絡(luò)阻滯，故表現(xiàn)為肢體麻木、疼痛，肢涼不溫等癥。因此，論治消渴病的并發(fā)癥周圍神經(jīng)病變采用溫潤通絡(luò)治法，以溫潤為主，溫陽養(yǎng)陰、活血祛瘀、化痰通絡(luò)。綜上所述，溫潤通絡(luò)方不僅降低DM大鼠坐骨神經(jīng)AR和SNS含量提高Na+-K+-ATP酶活性，促進(jìn)坐骨神經(jīng)及其周圍組織中的VEGF、bFGF表達(dá)，說明溫潤通絡(luò)法可調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞多元醇代謝，加強(qiáng)對周圍神經(jīng)功能的保護(hù)作用而改善坐骨神經(jīng)病變，緩解局部癥狀，達(dá)到治療DPN的作用。