水稻惡苗病菌對氟啶胺的敏感性及與其他殺菌劑的比較

潘 登，馬甜甜，許江巖，王 寧，宋立妹，張軍民，潘以樓?

(1 句容市希望生物科技有限公司，句容212400；2句容市希望農(nóng)業(yè)科技咨詢服務(wù)中心，句容212400)

潘登，馬甜甜，許江巖，等.水稻惡苗病菌對氟啶胺的敏感性及與其他殺菌劑的比較[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020，36(4)：77-82

水稻惡苗病(Rice bakanae disease)是由鐮刀菌[Fusarium verticillioidesNirenberg(F.fujikuroi)]引起的種傳病害[1-3]，可造成10%—50%的產(chǎn)量損失[4-5]。 上世紀80 年代初，相繼在長江流域稻區(qū)和東北稻區(qū)發(fā)生。 水稻惡苗病發(fā)生程度受環(huán)境因素的影響較大，與品種、育秧方式等也有較大關(guān)系[6-7]。 改旱育秧為水育秧、降低稻種催芽時溫度或不經(jīng)高溫催芽等措施，可以減輕惡苗病的發(fā)生，但防治水稻惡苗病最有效的方法仍是種子化學(xué)藥劑或生物制劑的拌種、浸種、包衣等處理措施[6]。 上世紀70 年代前，無機殺菌劑(有機汞、有機硫、石灰水、福爾馬林等)是防治稻惡苗病的主要藥劑，這些藥劑安全性差，且易殘留，已被多菌靈(MBC)等苯并咪唑類殺菌劑取代[8]。 上世紀90 年代，稻惡苗病菌對多菌靈產(chǎn)生了抗藥性，多菌靈逐漸被咪鮮胺取代[9-10]。 目前，溴硝醇[11]、氰烯菌酯[12-13]、二硫氰基甲烷(浸種靈)[14]和殼聚糖[15]及生物制劑[16-17]對水稻惡苗病具有較好的防治效果，但生產(chǎn)上仍以咪鮮胺以及混劑作為防治稻惡苗病的主要制劑[18]。 但單一藥劑的長期使用使稻惡苗病菌對咪鮮胺產(chǎn)生抗性，且抗性菌株的比例逐年上升[18-24]，且這些抗性菌株具有較高的適合度，可以在田間形成優(yōu)勢種群[8，24]。 因此，篩選新的殺菌劑用于水稻惡苗病的防治是目前面臨的迫切問題。

氟啶胺(Fluazinam)是吡啶胺類(Pyridines)新型殺菌劑，通過抑制病原菌細胞線粒體膜內(nèi)外電子傳導(dǎo)，影響病菌能量合成，抑制病菌生長；其對植物病原真菌的菌絲生長、孢子形成和孢子萌發(fā)、侵入器官的形成、游動孢子釋放等各個生長階段均有較強的抑制作用，可用于防治蘋果鏈格孢葉斑病、葡萄灰霉病、大豆灰霉病、小麥雪腐病、馬鈴薯晚疫病、大白菜根腐病、辣椒疫病等[25-27]。 室內(nèi)測定和田間試驗表明，氟啶胺對水稻惡苗病菌具有較強的抑菌活性，已將其應(yīng)用于生產(chǎn)[28-29]，但F.verticillioides對其的抗藥性風(fēng)險如何，還未見報道。 本研究通過室內(nèi)毒力測定，明確F.verticillioides對氟啶胺的敏感性及其敏感基線，并比較氟啶胺與生產(chǎn)上常用殺菌劑對F.verticillioides活性，以期為F.verticillioides對氟啶胺抗藥性風(fēng)險評估和抗藥性檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

1998—2012 年，在江蘇宜興、常熟、張家港、如東、如皋、泰興、句容市(縣)和上海市奉賢、金山、崇明區(qū)采集水稻惡苗病病株，用紙袋裝好帶回實驗室。 采集病株的稻田未使用過氟啶胺。 病株用清水反復(fù)沖洗，置于培養(yǎng)皿中保溫3—4 d，挑取病株上的霉層置于馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養(yǎng)基上，每1 病株作為1個菌株，編號。 將菌株進行單孢分離[30]，按Summerell 等[31]方法進行鑒定，確定為F.verticillioides的菌株轉(zhuǎn)入PSA 斜面上，保存于4 ℃冰箱中，每6—7 月轉(zhuǎn)管1 次。 隨機選擇幾個菌株從斜面轉(zhuǎn)接到PSA 平皿，備用。

1.2 供試藥劑

98%氟啶胺(Fluazinam)原藥，浙江禾田化工有限公司；96%多菌靈(Carbendazim)原藥，上海升聯(lián)化工有限公司；95.3%戊唑醇(Tebuconazole)原藥，鹽城利民化工有限公司；95%氰烯菌酯(Phenamacril)原藥，江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司；97%咪鮮胺(Prochloraz)原藥，江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司；99%二硫氰基甲烷(Diisothiocyanatomethane)原藥，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院農(nóng)藥系提供；30%氟菌唑(Triflumizole)可濕性粉劑，日本曹達株式會社生產(chǎn)，市售。

多菌靈等供試原藥按文獻[32]的方法配制成2 000 μg∕mL 的母液。 30%氟菌唑可濕性粉劑用滅菌水溶解成2 000 μg∕mL 母液。 在藥劑母液中加入2% Tween-80 作為乳化劑。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)：見文獻[30]。

1.4 F.verticillioides 對氟啶胺的敏感性

采用菌絲生長速率法進行測定[32-34]。 用滅菌水(含0.2% Tween-80)稀釋氟啶胺母液，在PSA 冷卻到50 ℃左右時加入不同濃度的氟啶胺溶液，制成最終含氟啶胺0(CK)、0.01 μg∕mL、0.05 μg∕mL、0.1 μg∕mL、0.5 μg∕mL、1.0 μg∕mL、5.0 μg∕mL 的系列含藥平板。F. verticillioides預(yù)培養(yǎng)5 d，制取直徑5 mm的菌碟接種于含藥平板上(菌絲面向下)，每皿1 個菌碟，每處理3 次重復(fù)。 25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d，十字交叉法量取菌落直徑(mm)，取平均值。

抑制率=[(CK 的菌落直徑-處理的菌落直徑)∕(CK 的菌落直徑-5)] ×100%。

通過濃度對數(shù)值(X)和抑制率幾率值(Y)之間的線性回歸關(guān)系求出毒力回歸方程和EC50值。

1.5 不同作用機制殺菌劑對F.verticillioides 的活性

按1.4 方法分別配制含戊唑醇(0.01 μg∕mL、0.05 μg∕mL、0.1 μg∕mL、0.5 μg∕mL、1.0 μg∕mL、10 μg∕mL)、咪鮮胺(0.01 μg∕mL、0.05 μg∕mL、0.1 μg∕mL、0.5 μg∕mL、1.0 μg∕mL、5 μg∕mL)、氰烯菌酯(0.01 μg∕mL、0.05 μg∕mL、0.1 μg∕mL、0.5 μg∕mL、1.0 μg∕mL、5 μg∕mL)、多 菌 靈(0.031 25 μg∕mL、0.062 5 μg∕mL、0.125 μg∕mL、0.25 μg∕mL、0.5 μg∕mL、1 μg∕mL)、氟 菌 唑(0.01 μg∕mL、0.05 μg∕mL、0.1 μg∕mL、0.5 μg∕mL、1.0 μg∕mL、5 μg∕mL)和二硫氰基甲烷(0.125 μg∕mL、0.25 μg∕mL、0.5 μg∕mL、1 μg∕mL、2 μg∕mL、4 μg∕mL)系列濃度的PSA 平皿。 選用Fa6(氟啶胺的EC50值0.054 4 μg∕mL)和CSH11-28(氟啶胺的EC50值0.601 0 μg∕mL)兩個菌株作為供試菌株，比較不同作用機制殺菌劑對F.verticillioides的毒力。

1.6 氟啶胺與不同作用機制殺菌劑的交互抗性

采用菌絲生長速率法[32]，選擇10 個F.verticillioides菌株(Fa6、KCa7、FFca4、ZJG20、U2-2、U-3-1、ZJG2-3、JG2-5、CSH11-28、JH6)作供試菌株，測定戊唑醇、咪鮮胺、氰烯菌酯、多菌靈、氟菌唑和二硫氰基甲烷抑制F.verticillioides菌絲生長的EC50值。 將這些菌株對氟啶胺的EC50值(敏感性)與對其他殺菌劑EC50值進行相關(guān)性分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用DPS7.05 軟件進行數(shù)據(jù)整理，用Excel 2003 軟件進行相關(guān)性分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 F.verticillioides 對氟啶胺的敏感性

供試的105 個F.verticillioides菌株，對氟啶胺的敏感性差異較大，EC50值最低為0.053 8 μg∕mL，最高為0.627 8 μg∕mL，兩者相差11.67 倍。 氟啶胺對105 個F. verticillioides菌株的EC50值呈正態(tài)分布，經(jīng)Shapiro-Wilks 檢驗，P=0.159 7(圖1)。 氟啶胺抑制F.verticillioides菌絲生長的EC50值平均為(0.267 4 ±0.151 6)μg∕mL。

2.2 不同地區(qū)F.verticillioides 對氟啶胺敏感性差異

各市(縣)菌株對氟啶胺的敏感性見表1。 來源于不同地區(qū)的F.verticillioides菌株對氟啶胺的敏感性差異不明顯；來源于句容市的F. verticillioides菌株對氟啶胺的敏感性最低，平均EC50值為(0.334 7 ±0.144 8)μg∕mL；來源于泰興的F. verticillioides菌株對氟啶胺的敏感性最高，平均EC50值為(0.175 9 ±0.040 0)μg∕mL。

表1 不同地區(qū)F.verticillioides 菌株對氟啶胺的敏感性Table 1 Sensitivity of isolate of F.verticillioides from difference regions to fluazinam

2.3 不同作用機制的殺菌劑對F.verticillioides 的敏感性

7 種殺菌劑對Fa6 菌株菌絲生長抑制活性由低到高依次為二硫氰基甲烷、氟菌唑、多菌靈、氰烯菌酯、戊唑醇、氟啶胺、咪鮮胺；對CSH11-28 菌株菌絲生長抑制活性由低到高依次為氟菌唑、二硫氰基甲烷、氟啶胺、多菌靈、戊唑醇、氰烯菌酯、咪鮮胺(表2)。 表明，氟啶胺對F.verticillioides的抑菌效果優(yōu)于多菌靈、二硫氰基甲烷和氟菌唑，低于酰胺類殺菌劑咪鮮胺。

表2 F.verticillioides 對不同殺菌劑的敏感性Table 2 Sensitivity of F.verticillioides to diverse fungicides

2.4 氟啶胺與不同作用機制殺菌劑的交互抗性

U-3-1 抗氰烯菌酯EC50值為7.284 0 μg∕mL，JG2-5 抗多菌靈EC50值為5.001 0 μg∕mL，其他菌株對供試藥劑均表現(xiàn)為野生敏感型。 通過EC50值線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)氟啶胺與二硫氰基甲烷、氟菌唑、多菌靈、氰烯菌酯、戊唑醇和咪鮮胺的決定系數(shù)分別是0.483 6(p=0.037 5)、0.342 7(p=0.038 4)、0.094 9(p=0.044 9)、0.108 8(p=0.357 4)、0.271 4(p=0.116 9)和0.367 4(p=0.042 8)。 表明，氟啶胺抑制F.verticillioides菌絲生長的EC50值與供試的其他6 種殺菌劑抑制F.verticillioides菌絲生長的EC50值之間相關(guān)性不顯著，說明氟啶胺與這6 種殺菌劑之間不存在交互抗性(圖2)。

3 結(jié)論與討論

研究表明，氟啶胺對番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)抑菌EC50值在0.001 6—0.053 1 μg∕mL[35]，對馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)抑菌EC50值在0.203 3—0.783 7 μg∕mL[36]，對水稻惡苗病菌抑菌EC50值為0.334 2 μg∕mL[28]。 本研究中，菌株采集地區(qū)還未使用氟啶胺進行水稻惡苗病防治，這些菌株是氟啶胺野生敏感菌株；氟啶胺對105 個F. verticillioides菌株的EC50值呈連續(xù)的線性分布(圖1)，均值為(0.267 4 ±0.151 6)μg∕mL，可作為F.verticillioides對氟啶胺的敏感基線。

氟啶胺對番茄灰霉病菌不同菌株抑制菌絲生長的EC50值相差33.19 倍[35]；馬鈴薯晚疫病菌不同菌株對氟啶胺的敏感性差異不大[36]。 本研究中，氟啶胺對F.verticillioides不同菌株的EC50值差異可達11.67倍；這與紀建軍[35]的研究結(jié)果相近，句容市菌株的EC50值最高，平均為0.334 7 μg∕mL；泰興市菌株的EC50值最小，平均為0.175 9 μg∕mL；地區(qū)間菌株的平均EC50值無顯著差異(表1)，表明不同菌株對氟啶胺的敏感性差異來源于菌株本身。

比較氟啶胺、戊唑醇、咪鮮胺、氰烯菌酯、氟菌唑、二硫氰基甲烷和多菌靈對F. verticillioides的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)氟啶胺對F.verticillioides的抑菌效果優(yōu)于多菌靈、二硫氰基甲烷和氟菌唑，抑菌效果明顯低于咪鮮胺(表2)。 目前，F(xiàn).verticillioides對多菌靈、咪鮮胺產(chǎn)生了明顯的抗藥性[20-24]，氟啶胺可以作為替代藥劑之一用于水稻惡苗病的防治。 筆者用80—120 μg∕mL 的50%氟啶胺SC 藥液浸漬水稻種子48 h，對水稻惡苗病的防治率在93.7%—100%(個人資料，待發(fā)表)。

將F.verticillioides對氟啶胺及戊唑醇、咪鮮胺、氰烯菌酯、氟菌唑、二硫氰基甲烷、多菌靈的敏感性的EC50值進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)氟啶胺與其他供試的6 種殺菌劑對F.verticillioides敏感性沒有顯著相關(guān)性，說明F.verticillioides對氟啶胺與上述殺菌劑之間不存在交互抗性。 推測在目前F.verticillioides對多菌靈、咪鮮胺產(chǎn)生了明顯的抗藥性情況下，氟啶胺在生產(chǎn)上更有應(yīng)用價值。

本研究測定了F.verticillioides對氟啶胺的敏感基線，比較了目前生產(chǎn)上應(yīng)用于水稻惡苗病防治的6種殺菌劑對F.verticillioides活性的差異。 室內(nèi)藥劑馴化發(fā)現(xiàn)，番茄灰霉病菌對氟啶胺不易產(chǎn)生抗藥性突變[35]；而F.verticillioides對氟啶胺抗藥性風(fēng)險如何，還未見報道。 下一步將在田間條件下比較氟啶胺和其他殺菌劑對水稻惡苗病的防治效果以及氟啶胺應(yīng)用后F.verticillioides對氟啶胺的敏感性變化。