生菜葉片完整性對金黃色葡萄球菌生長的影響

瞿 洋，白亞龍，林 婷，索玉娟，周昌艷

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，上海201403)

瞿洋，白亞龍，林婷，等.生菜葉片完整性對金黃色葡萄球菌生長的影響[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020，36(4)：89-93

食源性致病菌在自然界分布廣泛，可通過多種途徑污染生鮮蔬果，國外已發(fā)生多起食用生鮮蔬果引起的食源性疫情。 例如，2011 年美國18 個州因食用被單增李斯特菌污染的哈密瓜暴發(fā)食源性疫情，導(dǎo)致146 人患病30 人死亡；2016 年美國因黃瓜暴發(fā)沙門氏菌疫情，導(dǎo)致至少907 人感染，其中6 人死亡，204人住院；2018 年美國32 個州因生菜污染大腸桿菌O157：H7 暴發(fā)疫情，導(dǎo)致172 人食物中毒[1-2]。 隨著人們對飲食營養(yǎng)要求的提高及生活節(jié)奏的加快，越來越多的人選擇無需加工或微加工的新鮮蔬果制品，這類食品一旦被致病菌污染，將對人體健康造成隱患。

金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生耐熱的腸毒素，其引起的食物中毒潛伏期一般較短(1—6 h)，常見的癥狀包括干嘔、惡心、嘔吐、咳嗽、腹痛、腹瀉、胸痛。 患者體溫大多略高，有些病例有發(fā)熱、出汗、頭暈、頭痛、血壓的變化等癥狀，嚴(yán)重的病例可能出現(xiàn)中毒、休克[3-4]]。 無論在發(fā)達(dá)國家還是在發(fā)展中國家，由該菌引起的食物中毒病例在細(xì)菌性食物中毒中均占較大比例。 在我國，20%—25%的細(xì)菌性食物中毒病例由金黃色葡萄球菌引起，它是僅次于沙門氏菌和副溶血性弧菌的第三大致病菌[5]。 生菜是我國種植和消費較多的一類即食葉菜，雖然我國還沒有出現(xiàn)因食用生菜而發(fā)生大規(guī)模疫情的安全事件，但國內(nèi)研究者發(fā)現(xiàn)綠葉菜中金黃色葡萄球菌的污染率為16.3%(53∕325)，國外也有報道稱金黃色葡萄球菌為即食生菜中的主要食源性致病菌[6-8]。 為預(yù)防金黃色葡萄球菌食物中毒，歐美等國已將食品安全關(guān)注點從食源性疾病暴發(fā)的事后調(diào)查轉(zhuǎn)移至食品污染的早期評估[2]。

針對金黃色葡萄球菌，國內(nèi)外已先后開展了其在肉制品、米面制品和乳制品中的風(fēng)險評估研究[9-11]，而在即食果蔬中的研究尚不完善。 關(guān)于生菜，國內(nèi)外主要開展了鮮切生菜中的預(yù)測微生物模型的建立[12-20]，尚無完整生菜葉片中食源性致病菌的相關(guān)研究。 考慮到生菜中金黃色葡萄球菌的高污染率，本研究從影響細(xì)菌生長的兩大因素：溫度和介質(zhì)狀態(tài)為切入點，探究這兩大因素對生菜上金黃色葡萄球菌生長的影響，提出生菜安全收、貯、運與消費的建議，為該菌在生菜中消長動力學(xué)模型的構(gòu)建與定量風(fēng)險評估研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2017 年7—10 月于上海市奉賢區(qū)金匯鎮(zhèn)超市和農(nóng)貿(mào)市場采集生菜；金黃色葡萄球菌于2017 年上半年自生菜中分離保存(按照GB 4789.10—2010 進(jìn)行分離鑒定；PCR 檢測該菌的特異基因nuc，證實其為金黃色葡萄球菌)。

Baird-Parker 培養(yǎng)基(BP)、磷酸鹽緩沖液(PBS)購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、腦心浸液肉湯(BHI)、瓊脂粉、利福平購于上海博蘊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋(TOMY，SX-500)；生物安全柜(Thermo scientific，1300 series A2)；恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏設(shè)備有限公司，DNP-9272 型)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司，TQZ-312 型)；電子天平(Mettler Toledo，AL104)；均質(zhì)儀(漯河市金田實驗設(shè)備研究所，JT-B∕JT-C 勻漿儀)；漩渦混勻儀(Vortex Genie，Scientific Industries)。

1.3 方法

1.3.1 菌株利福平抗性誘導(dǎo)

利福平誘導(dǎo)濃度見表1。 用無菌接種環(huán)蘸取適量甘油冷凍管中的金黃色葡萄球菌分離株，在固體BHI平板上劃線分離，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置，培養(yǎng)過夜。 用無菌接種環(huán)挑取單菌落，接種于BHI 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，置于37 ℃恒溫?fù)u床中，過夜培養(yǎng)。 將活化的金黃色葡萄球菌分離株按照1∶100 接種于含BHI液體培養(yǎng)基(含低濃度利福平)中，置于37 ℃恒溫?fù)u床中過夜培養(yǎng)至穩(wěn)定期，將有低濃度利福平抗性的金黃色葡萄球菌按照1∶100 接種于含BHI 液體培養(yǎng)基(含高濃度利福平)中，置于37 ℃恒溫?fù)u床中過夜培養(yǎng)至穩(wěn)定期，如此遞進(jìn)，將耐受120 mg∕L 的金黃色葡萄球菌劃線接種于含120 mg∕L 濃度利福平的BHI 平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜，用甘油管冷凍保存該菌株。 最終，金黃色葡萄球菌生菜分離株由最初的5 mg∕L耐受濃度被誘導(dǎo)為120 mg∕L 的耐受濃度。 為減小濃度誤差，本研究最終選用100 mg∕L 的利福平為目的菌的篩選濃度。 在該濃度下的BP 平板上，生菜葉上的背景菌均無明顯生長。

表1 利福平誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌的濃度Table 1 The concentration of rifampicin induced S.aureus

1.3.2 菌懸液的制備

無菌條件下挑取利福平抗性的金黃色葡萄球菌單菌落于BHI(含100 mg∕L 利福平)中過夜培養(yǎng)至穩(wěn)定期，取該穩(wěn)定期新鮮菌液1 ml 于9 ml PBS 中，混勻，10 倍梯度稀釋至104CFU∕mL，備用。

1.3.3 樣品制備

選取市場新鮮生菜樣品，去除外層葉片后，摘取約10 g 完整葉片置于均質(zhì)袋中備用；鮮切生菜樣品為4 cm×4 cm 大小，每份約10 g，置于均質(zhì)袋中備用。

1.3.4 接種

取1.3.2 中制備的菌懸液100 μl，按照點植法[21]涂抹于葉片上，風(fēng)干后將均質(zhì)袋封口，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.5 生長曲線測定

將1.3.4 中的樣品分別置于25 ℃和37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔一段時間，取出樣品，無菌條件下向均質(zhì)袋中加入100 ml PBS，均質(zhì)2 min；吸取1 ml 均質(zhì)液，按梯度進(jìn)行稀釋，吸取100 μL 稀釋液，涂布于含有利福平的BP 平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計數(shù)(有效計數(shù)范圍為30—300)。 每個溫度設(shè)置兩組平行試驗，以不接目的菌的生菜樣品為空白對照，生菜自身所帶細(xì)菌在該平板上均不生長。

1.3.6 微生物生長模型的建立

金黃色葡萄球菌在鮮切生菜中生長數(shù)據(jù)采用修正No Lag Phase Growth 模型擬合，模型表達(dá)式如下：

其中，t：培養(yǎng)時間，h；Y(t)：t時的微生物數(shù)量，lg CFU∕g；Y0：初始微生物數(shù)量，lg CFU∕g；Ymax：最大菌落數(shù)，lg CFU∕g；μmax：微生物生長速率，lg CFU∕g∕h 。

1.3.7 模型的擬合指標(biāo)

RMSE(residual standard error)是殘差分析法的一個重要指標(biāo)，可以評價數(shù)據(jù)的變化程度，RMSE 的值越小，說明預(yù)測模型精確度越好。 通常RMSE ＜0.5 lg CFU∕g，為試驗誤差的正常范圍[22]。

式中，n為試驗數(shù)據(jù)總數(shù)；p為模型中參數(shù)的個數(shù)。

式中，yi為第i時的實測值；^yi是第i時的預(yù)測值。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌在完整葉片上的生長狀況

從圖1 可知，25 ℃培養(yǎng)時，金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)在3.61 lg CFU∕g—3.88 lg CFU∕g，金黃色葡萄球菌生長值小于0.50 lg CFU∕g；37 ℃培養(yǎng)時，金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)在2.92 lg CFU∕g—3.59 lg CFU∕g，金黃色葡萄球菌生長值小于0.70 lg CFU∕g。 表明，無論是在25 ℃還是在37 ℃下培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌在完整生菜葉片上的增殖能力均小于1.00 lg CFU∕g。 同時，金黃色葡萄球菌在完整生菜葉片中的生長曲線無法呈現(xiàn)“S”型，即便測定值偏差較大，總體趨勢也更偏向于直線，表明該菌在完整生菜葉片上無明顯增殖，同時不能使用預(yù)測微生物學(xué)模型進(jìn)行擬合。

2.2 金黃色葡萄球菌在鮮切葉片上的生長狀況

從表2 可知，金黃色葡萄球菌在鮮切生菜中的生長曲線RMSE 值均小于0.5 lg CFU∕g，能較好地與No Lag Phase Growth 模型擬合。 圖2(A)顯示，25 ℃下金黃色葡萄球菌初始接菌量為3.03 lg CFU∕g 時，經(jīng)過84 h 培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌的生長值大于1.00 lg CFU∕g，最大菌落數(shù)為4.08 lg CFU∕g；圖2(B)顯示，37 ℃時，金黃色葡萄球菌的的初始接菌量為2.99 lg CFU∕g，同時，隨著時間延長，金黃色葡萄球菌的生長值和最大菌落數(shù)變大，分別為2.51 lg CFU∕g 和5.50 lg CFU∕g。

此外，金黃色葡萄球菌在鮮切生菜中的生長速率(μmax)和最大菌落數(shù)與溫度有緊密聯(lián)系。 當(dāng)溫度升高時，金黃色葡萄球菌的生長速率會變大，當(dāng)溫度為25 ℃時，金黃色葡萄球菌的生長速率為0.06 lg CFU∕(g·h)，生長較緩慢；當(dāng)溫度為37 ℃時，生長速率為0.35 lg CFU∕(g·h)，遠(yuǎn)高于25 ℃時的生長速率(表2)。

表2 鮮切生菜中金黃色葡萄球菌在不同溫度下的生長參數(shù)Table 2 The growth value of S.aureus on intact lettuce leaves

3 結(jié)論與討論

本研究針對生菜中污染率較高的金黃色葡萄球菌，比較了其在完整生菜葉片和鮮切葉片兩種狀態(tài)中的生長狀況，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌在室溫(25 ℃)和適溫(37 ℃)下，分別培養(yǎng)84 h 和48 h，在完整葉片上均無明顯增殖，而在鮮切葉片上有明顯長勢，適溫下最高可長至5.50 lg CFU∕g。

生菜葉片上的背景微生物對致病菌的生長可能會產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用[24]，為了描述實際環(huán)境中金黃色葡萄球菌在生菜上的生長狀況，本研究未對采集的生菜樣品進(jìn)行清洗和消毒處理，而是利用帶有抗性的目的菌進(jìn)行生長測定，更客觀地分析金黃色葡萄球菌在有背景微生物存在下的生長狀況。 生菜等鮮食農(nóng)產(chǎn)品與其他食品材質(zhì)相比，其研究的難點在于材質(zhì)的非均一性與葉片自身攜帶微生物的復(fù)雜性。 生菜葉脈、氣孔密度、葉片表面疏水性及可溶性蛋白均會導(dǎo)致細(xì)菌在葉片上的黏附差異[23]。 本研究選取了超市及農(nóng)貿(mào)市場的羅馬生菜及奶油生菜樣品進(jìn)行比較，結(jié)果顯示即便在細(xì)菌適宜的生長溫度37 ℃下，金黃色葡萄球菌在完整的葉片上也不會增殖。

金黃色葡萄球菌食物中毒主要是由其產(chǎn)生的腸毒素引起，以往多是研究食物中的菌濃度，而很少有食物中具體的腸毒素含量檢測數(shù)據(jù)。 一般認(rèn)為食物中金黃色葡萄球菌含量達(dá)到105CFU∕g 即可產(chǎn)生毒素，因此，105CFU∕g 這個濃度值被認(rèn)為是導(dǎo)致食物中毒的最小濃度[25-27]。 鮮切生菜葉片上，切割造成的機(jī)械損傷使得葉片營養(yǎng)物質(zhì)外流，導(dǎo)致微生物侵染生菜內(nèi)部組織進(jìn)而生存繁殖[28]。 本研究中，室溫下金黃色葡萄球菌雖有增殖，但僅增長了一個對數(shù)值，達(dá)104CFU∕g，小于105CFU∕g 的產(chǎn)毒理論濃度，而適溫下(37 ℃)，金黃色葡萄球菌經(jīng)9 h 增殖，可增長至105CFU∕g，表明鮮切生菜葉片在高溫下可以達(dá)到理論上誘發(fā)腸毒素產(chǎn)生的濃度，這也與已有研究認(rèn)為溫度是影響致病菌在葉片上生長的重要因素一致[29]。

該研究探討了生菜葉片完整性對金黃色葡萄球菌生長的影響，認(rèn)為在細(xì)菌適宜的生長溫度下，保持葉片的完整性對抑制金黃色葡萄球菌的生長極其重要，建議今后生菜中金黃色葡萄球菌的定量風(fēng)險評估研究其相關(guān)預(yù)測微生物學(xué)模型的構(gòu)建應(yīng)重點在鮮切葉片中，生菜收、貯、運及選購過程中應(yīng)盡量避免葉片的損傷與交叉污染的發(fā)生，夏季加工鮮切生菜后應(yīng)及時食用或放于冰箱低溫保存。