HPLC測定處方中大黃素和大黃酚的含量*

洪開文，宋 倫，鄭 重,陳 懿，盧海莎

(1 安順職業技術學院應用醫藥系，貴州 安順 561000；2 黔中民族藥(苗藥)資源開發與產業化協同創新中心，貴州 安順 561000)

黔中屯堡地區多年來使用含有中大黃、眼子菜、刺梨根、龍牙草等4味藥材組成酒劑處方，經過實踐證明，該處方具有清熱通便、止血等功效，在黔中屯堡地區用于酒泡服后治療便秘、痔瘡等療效顯著。方中大黃為主要藥材之一，具有明顯瀉下作用。研究表明，以大黃素、大黃酚等為代表的游離蒽醌類化合物是大黃的主要有效成分[1]。本研究通過HPLC法測定處方中大黃素和大黃酚含量，作為內在質量控制指標之一。

1 儀器與試劑

1.1 儀 器

LC-20AT高效液相色譜儀，日本津島；Elmasonic Easy30H超聲清洗機；PTX-FA110S電子天平；艾柯exceed-c實驗室專用超純水機。

1.2 試 劑

大黃素對照品(批號 110756-200111，供含量測定用)、大黃酚對照品(批號110796-201318，供含量測定用)，甲醇為色譜純，磷酸為分析純，提取用的甲醇、二氯甲烷等為分析純，水為實驗室自制超純水。

2 實驗方法

2.1 色譜條件[2]

固定相：依立特C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15，V/V)；檢測波長為240 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；理論塔板數按大黃素峰計算應不低于3500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取干燥的大黃素對照品、大黃酚對照品適量，加甲醇溶液溶解，分別制成每1 mL含大黃素10.16 μg、大黃酚28.38 μg的混合溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備[3-6]

取處方當量藥材粉末(過四號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，加熱回流45 min，放冷，密塞，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液10 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 Hz)5 min，再加二氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，冷卻，移至分液漏斗中，用少量二氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取二氯甲烷液，酸液用二氯甲烷振搖提取2次，每次15 mL，合并二氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶液使溶解，轉移至25 mL量瓶中，加甲醇溶液至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔膜濾過，取續濾液作為樣品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備

取缺大黃陰性混合粉末樣品，按2.2.2項下樣品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

3 空白實驗

圖1陰性樣品溶液

圖2樣品溶液

圖3對照品溶液

分別吸取“2.2”項下的混合對照品溶液、空白試劑、樣品溶液及陰性樣品溶液，注入高效液相色譜儀進行測定。結果：陰性樣品溶液中不含大黃酚、大黃素的峰。見圖1、圖2、圖3。

4 方法學考察

4.1 線性關系考察

精密稱取大黃素對照品、大黃酚對照品適量，加甲醇溶液溶解分別制成每1 mL含大黃素、大黃酚各10.16 μg、28.38 μg的混合溶液，精密吸取0、5、10、15、20、25 μL依次注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件進行測定，以峰面積積分值為縱坐標，對照品進樣量(μg)為橫坐標，繪制標準曲線，大黃素線性回歸方程為Y=99335X+458.5，r=0.9996，大黃酚線性回歸方程為Y=39468X+1380，r=0.9998。結果表明，大黃素進樣量在0.0508～0.2540 μg線性范圍內與峰面積呈線性關系，大黃酚進樣量在0.1419～0.7095 μg線性范圍內與峰面積呈線性關系。

4.2 重復性實驗

取同一批次樣品，按“2.2”項下樣品的制備方法，平行制備6份樣品溶液，進樣10 μL進行測定，分別計算大黃素和大黃酚的RSD值。結果：大黃素和大黃酚的RSD值分別為1.26%、1.32%，即大黃素、大黃酚重復性好。

4.3 穩定性實驗

取同一批次樣品溶液，分別于0、0.5、1、2、3、4 h下進行進樣10 μL，按上述色譜條件測定大黃素、大黃酚的峰面積，并計算其RSD值。結果：大黃素和大黃酚的RSD值分別為2.1%、1.8%，即穩定性好。

4.4 精密度實驗

在上述色譜條件下，取按“2.2”項下配制的大黃素、大黃酚混合溶液分別連續進樣5次，每次取10 μL，分別計算大黃素和大黃酚峰面積的RSD值。結果：大黃素和大黃酚的RSD值分別為0.36%、0.65%，即精密度好。

4.5 回收率實驗

取同批次樣品6份，精密稱取1 g，分別精密加入大黃素對照品(6.1900 mg)和大黃酚對照品(9.7200 mg)，按“2.2”項下操作制備樣品溶液并測定，計算回收率和RSD值。結果：大黃素的平均回收率為98.71%(RSD=1.37%)，大黃酚的平均回收率為98.52%(RSD=1.31%)，見表1、表2。

表1 大黃素回收率實驗結果

表2 大黃酚回收率實驗結果

4.6 樣品測定

取樣品溶液10 μL，連續進樣3次，依法測定記錄各組分的峰面積值取平均值，分別計算，結果：大黃素含量為12.1856 mg/g、大黃酚含量為19.5257 mg/g。

5 結 論

按上述色譜條件，通過空白試驗，對陰性樣品溶液的測定在其峰的相應的位置上無干擾峰出現，說明處方中其他成分對測定結果無干擾，該提取方法簡單、具有專屬性，可以為該處方的質量標準研究提供依據。

本研究用二氯甲烷提取藥材，相比藥典的三氯甲烷提取，毒性更低，價格便宜，回流溫度低，且所測含量相差不大，實驗表明用二氯甲烷提取藥材是可行的。