新型大孔徑介孔二氧化硅吸附牛血清蛋白的性能研究

龐 明，牟 淵，劉俊翔，陳利群，周 彬

(1 嘉興求源檢測技術有限公司，浙江 嘉興 314001；2 嘉興港區(綜合保稅區)生態環境監測站，浙江 嘉興 314201)

自從1992年mobil公司發明MCM-41以來，介孔二氧化硅材料(mesoporous silica，MS)在這二十幾年的時間里經歷了飛速的發展。由于具有高比表面積、大孔容、優異的生物相容性、可修飾的表面以及可調節的孔徑(2～50 nm)，MS被廣泛應用于催化[1]、蛋白吸附分離[2-4]、光學[5]以及生物醫藥[6-8]等領域。除此之外，研究表明將蛋白裝載在介孔當中能夠提高蛋白的熱穩定性，因此MS在蛋白裝載領域具有巨大的應用潛力。相比于藥物分子，蛋白分子具有較大的分子尺寸，因此需要合成具有大介孔尺寸的MS。目前常見的合成大孔MS的方法是在合成過程中加入有機溶劑(如1,3,5-三甲苯)作為擴孔劑[9]。雖然使用這種方法合成的MS具有大孔徑和高孔容，但是有機溶劑的加入使合成過程變得復雜。

絕大多數MS的合成過程都是硅酸物種與有機模板作用形成有機無機復合物，然后將有機模板去除得到相應的介孔結構。高溫煅燒[10]和有機溶劑萃取[11-12]是兩種常見的去除有機模板的方法。雖然高溫煅燒能夠徹底去除有機模板，但是在高溫下(550 ℃)有機模板脫除的同時材料內外表面的大量Si-OH也會隨之消失。大量Si-OH的存在不僅能夠增強MS的親水性，更重要的是能夠使MS的功能化變的容易，因此在MS的應用中起到關鍵作用。有機溶劑萃取在較低溫度(< 100 ℃)下進行，可以避免Si-OH的失去，但是即使重復多次也不能夠將有機模板完全去除。目前還沒有一種方法能夠合成出不帶有機模板的MS。

本文利用簡單的一步法創新地合成了不帶模板劑的新型大孔徑介孔氧化硅(large pore mesoporous silica，LPMS)。然后對LPMS的合成機理進行了闡釋。最后，選擇牛血清蛋白(BSA)作為模型蛋白研究LPMS對蛋白的吸附能力，研究的LPMS的吸附動力學和吸附等溫線。

1 實 驗

1.1 試劑及儀器

嵌段共聚物PEO20-PPO70-PEO20(P123)，BASF；牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA)，Aldrich；正硅酸乙酯、濃鹽酸、無水乙醇、醋酸，上海凌鋒化學試劑有限公司(均為分析純)；去離子水，自制。

S-4800掃描電子顯微鏡(SEM，加速電壓1.0 kV)；X射線衍射光譜儀，比表面積和孔尺寸分析儀(Micromeritics Tristar II 3020)；FT-IR傅里葉紅外分析儀，Nicolet；NETZSCH STA 409PC熱重分析儀，TGA。

1.2 大孔徑介孔二氧化硅的制備

制備LPMS的具體步驟如下：首先2.0 g P123溶解在70 mL去離子水和20 mL HCl(2 mol/L)的混合溶液中，將1.2 g TEOS加入上述溶液后，在室溫下劇烈攪拌30 min。得到的混合物轉移到100 mL聚四氟乙烯內襯的高溫高壓反應釜內，在80 ℃下處理6 h后，將溫度升至160 ℃并保持12 h。通過抽濾得到產物，并用大量去離子水和乙醇洗滌，在100 ℃下真空干燥過夜，即的到白色LPMS粉末。作為對比將干燥后的LPMS在馬弗爐中550 ℃下煅燒6 h，升溫速率為1.5 ℃/min，得到的樣品命名為LPMS-cal。

1.3 牛血清蛋白吸附性能研究

靜態吸附實驗：20 mg LPMS和LPMS-cal加入到20 mL裝有不同BSA濃度的羅口瓶中(濃度范圍0.10～0.60 mg/mL)，吸附一定時間后，離心分離，用UV-vis光譜測定BSA的平衡濃度，計算LPMS和LPMS-cal對BSA的吸附容量。動態吸附實驗：通過測定不同吸附時間下的吸附容量來研究LPMS和LPMS-cal的動力學模型。20 mg LPMS/LPMS-cal加入到20 mL裝有固定BSA濃度的羅口瓶中，吸附時間為5～120 min，用UV-vis光譜測定不同吸附時間下的吸附容量。LPMS和LPMS-cal的吸附動力學用準一、二級動力學模型進行擬合。吸附等溫線用Langmiur和Freundlich模型進行擬合。

兩種動力學模型的方程表達式為：

準一級動力學模型：

ln(qe-qt)=lnqe-k1t

(1)

準二級動力學模型：

(2)

其中：qe為LPMS/LPMS-cal的平衡吸附容量，mg/g；qt為時間t時的吸附容量，mg/g。k1和k2分別是準一級、準二級吸附速率常數。

Langmiur模型的線性數學表達式表示為：

(3)

Ce是BSA的平衡濃度，mg/L；qe是平衡時的吸附容量，mg/g；kL為Langmuir 常數，L/mg；qmax代表最大吸附容量，mg/g。

Freundlich吸附等式的線性形式如下：

logqe=logkF+(n)logCe

(4)

kF是Freundlich 常數，mmol1-n·Ln·g-1;n是吸附強度。

2 結果與討論

2.1 LPMS的表征

圖1a，b是LPMS不同倍數的SEM照片。通過低倍SEM照片(圖1a)可以看出LPMS是一種類球形的顆粒，尺寸大約在5～10 μm，而在高倍的SEM照片(圖1b)中可以清晰觀察到LPMS表面的介孔結構。

圖1 LPMS不同倍數的SEM照片(a，b)和LPMS的廣角XRD圖譜(c)

圖2 LPMS的小角X射線衍射(a)和小角X射線散射(b)

圖1c為LPMS的廣角XRD譜圖，可以看出LPMS在22°左右有一個寬化的衍射峰，這表明LPMS是典型的無定形態SiO2。圖2a為LPMS的SAXRD圖譜，通過SAXRD圖譜可以觀察到LPMS在0.6°～6°沒有衍射峰；圖2b為LPMS的SXRS圖譜，可以觀察到在0.4°左右出現了明顯的散射峰。由布拉格方程原理可知，當介孔材料的介孔尺寸增大時，衍射峰向小角移動，因此可以進一步證明LPMS的大孔結構。

圖3a是LPMS和LPMS-cal的紅外譜圖。由文獻可知，P123的紅外特征峰為C-H的伸縮振動峰(2860～2976 cm-1)和彎曲振動峰(1350～1460 cm-1)。而在LPMS和LPMS-cal的紅外圖譜上只觀察到了Si-O-Si的特征峰(1085、800以及470 cm-1)和Si-OH的特征峰(960 cm-1)，并沒有觀察到C-H的特征峰，這表明樣品中均不含有機模板劑。更為重要的是LPMS的Si-OH特征峰強度明顯強于LPMS-cal，這是由于高溫煅燒造成了LPMS-cal內外表面大量Si-OH損失。和無機骨架相比，有機模板分解溫度低，因此TG是一種判斷介孔材料中有機模板含量的有效方法。對于傳統的介孔二氧化硅材料(如SBA-15、MCM-41等)，在沒有去除有機模板之前材料的熱失重主要分為兩個階段：(1)150 ℃之前，失重主要來自于吸附的水分子的脫除；(2)180 ℃以后，失重主要來自于有機模板分解，有一少部分是由于Si-OH的縮合造成硅骨架失去結構水，由有機模板分解造成的熱失重一般在50%左右[13-14]。圖3b是煅燒前后樣品的TG曲線，可以看出熱重曲線也分為150 ℃之前和180 ℃之后兩個階段，但LPMS和LPMS-cal在180 ℃以后的失重分別僅為7.2%和4.1%，遠遠低于50%，進一步證明制備的介孔材料中不含有機模板。LPMS在180 ℃以后的失重略大于LPMS-cal，這是由于LPMS內外表面的Si-OH數量比LPMS-cal多造成的。圖3c是樣品的氮氣吸附脫附等溫線，可以看出煅燒前后的樣品等溫線基本一致，都是典型的IV型等溫線，遲滯環為H1型，并且遲滯環的位置在相對壓力較高的區域(0.8～0.9)，這表明LPMS具有分布窄且尺寸大的介孔結構。圖3d是由吸附分支計算得到的BJH孔徑分布圖，可以看出煅燒前后LPMS孔徑分布均比較窄，但LPMS-cal的孔徑(20.3 nm)略小于LPMS的孔徑(22.8 nm)，這是由于高溫煅燒會造成硅骨架進一步收縮，從而導致孔徑略有減少。除此之外，LPMS和LPMS-cal的比表面積和孔容基本一致(表1)。氮氣吸附脫附分析結果表明，在LPMS的合成過程中有機模板已經被脫除，得到的LPMS已經具有良好的介孔結構，不需要通過后處理去除有機模板來得到介孔結構。

表1 樣品的介孔結構參數

圖3 LPMS和LPMS-cal的紅外譜圖(a)；熱重曲線(b)；氮氣吸附脫附等溫線(c)和孔徑分布圖(d)

2.2 LPMS合成機理探討

LPMS的合成體系與SBA-15相似，都是利用TEOS作為硅源，以及非離子三嵌段共聚物(P123)作為有機模板，P123在溶液中形成膠束，膠束內核為疏水的PPO，而外面則是親水的PEO，在酸催化作用下TEOS水解并通過氫鍵與P123膠束親水端相結合形成有機無機復合體，最后去除有機模板得到具有介孔結構的無定形SiO2。雖然合成體系相似，但是合成出的材料卻有很大區別，(1)LPMS不僅具有大孔徑和高孔容，并且模板劑在合成過程中被完全脫除。孔徑的增大有以下兩點原因：①80 ℃反應過程中硅酸物種和P123膠束已經形成有機無機復合物，當溫度升高到160 ℃后，膠束的親水端PEO的親水性變得更弱，而疏水內核PPO的疏水性則相應增強，導致PEO部分收回到膠束內部并與疏水內核PPO靠近，這樣整個膠束的疏水部分變大。由于介孔孔徑大小主要依賴于疏水部分的鏈長，膠束疏水部分變大最終導致介孔孔徑變大；②隨著160 ℃水熱時間的增加，有機模板逐漸脫除，在脫除過程中會造成孔道合并，因此介孔孔徑會進一步增大，最終得到不含有機模板的大孔徑介孔氧化硅LPMS。

(2)體系的酸濃度不同。由于比SBA-15合成反應溫度高很多，如果繼續使用相同的酸濃度合成LPMS，那么硅酸物種的水解聚合過快會嚴重影響與有機模板的共組過程。因此降低酸濃度改善了硅酸物種的水解聚合，這樣能夠與整個共組過程相匹配，很好的形成有機無機復合物，從而形成介孔結構。

圖4 LPMS合成的機理圖

圖4是LPMS的合成示意圖。①是硅酸物種和P123膠束在酸性溶液中80 ℃水熱下形成有機無機復合物的過程，即形成介孔結構的過程；②是在160 ℃水熱初期由于親水端PEO的親水性降低，疏水端PPO的疏水性增強，導致PEO部分收回到膠束內部并與疏水內核PPO靠近，使膠束的疏水部分變大；③是隨著160 ℃水熱時間的增加模板劑逐漸脫除，介孔孔道合并形成更大尺寸的介孔，最終得到不含有機模板的大孔介孔二氧化硅LPMS，同時在內外表面保留了大量Si-OH。

2.3 牛血清蛋白的吸附性能研究

2.3.1 吸附動力學研究

LPMS和LPMS-cal的吸附動力學曲線如圖5a所示。從圖5中可以看到，在開始的50分鐘內LPMS和LPMS-cal對BSA的吸附表現出較快的吸附動力學，并且在接下來的20分鐘內吸附達到飽和。相比而言，LPMS-cal每個時間下的吸附容量都遠遠低于LPMS，而吸附達到平和時，LPMS和LPMS-cal的吸附容量分別達到了184.2 mg/g和140.8 mg/g，說明LPMS表面具有更多的硅羥基，能更加快速吸附并且高容量的吸附BSA。

實驗數據用準一級、準二級吸附動力學模型擬合的參數列于表2。通過對比兩種模型的線性相關系數R2和擬合得到的曲線可以發現準二級動力學模型都能夠描述LPMS和LPMS-cal吸附BSA的動力學過程(R2>0.99)。由準二級動力學擬合數據得到的LPMS和LPMS-cal的飽和吸附容量(183.8 mg/g和143.2 mg/g)與實驗測得的飽和吸附容量(184.2 mg/g和140.8 mg/g)非常接近，進一步說明LPMS和LPMS-cal吸附BSA主要是化學吸附過程。

圖5 LPMS和LPMS-cal的吸附動力學(a)；準一級動力學模型擬合曲線(b)；準二級動力學模型擬合曲線(c)

表2 LPMS and LPMS-cal對BSA的吸附動力學參數

2.3.2 吸附等溫線研究

考察了LPMS和LPMS-cal吸附BSA的吸附等溫線(圖6)。從結果圖中可以看到LPMS和LPMS-cal對BSA的吸附容量隨著BSA初始濃度的增加而增加，當初始濃度為0.5 mg/mL時吸附達到飽和，最大吸附容量分別為193.2 mg/g和143.8 mg/g。相比而言，LPMS的吸附容量比LPMS-cal的吸附容量要大，研究表明LPMS表面Si-OH能夠與蛋白中的NH2形成氫鍵作用，因此大量Si-OH的存在有利于蛋白的吸附。兩種常用的等溫線模型對數據進行回歸分析，回歸曲線見圖7所示。計算所得相關參數列于表3，對比這兩種等溫模型得到的R2以及飽和吸附容量可知Freundlich模型能更好的描述LPMS和LPMS-cal對BSA的吸附過程，吸附數據對Freundlich模型有更好的一致性(R2>0.98)，說明LPMS和LPMS-cal吸附BSA是多分子的均勻吸附。

圖6 LPMS和LPMS-cal在不同濃度BSA溶液中的蛋白吸附量

圖7 Langmuir(a)和Freundlich(b)吸附等溫線方程對實驗數據的擬合圖

表3 LPMS和LPMS-cal吸附BSA的Langmuir和Freundlich的等溫模型擬合參數

3 結 論

(1)創新地利用一步法合成了大孔介孔二氧化硅(LPMS)。LPMS不僅具有大的介孔尺寸(22.8 nm)以及高的孔容(2.35 cm3/g)，更重要的是有機模板在合成過程中已經被完全去除，不需要后處理去除模板，簡化了合成工藝的同時保留了大量的Si-OH。

(2)對LPMS的合成機理進行了分析，發現相對較高的合成溫度降低了有機模板膠束的親水性，從而減弱了硅酸物種和有機模板膠束之間的作用力，使得有機模板在合成過程中被脫除，同時介孔孔徑相應擴大。另一方面，相對較低的酸濃度使硅酸物種在高溫下的水解速度和有機/無機共組裝過程相匹配，從而更好地形成介孔結構。

(3)選擇牛血清蛋白(BSA)作為模型蛋白研究LPMS和LPMS-cal對蛋白的吸附能力。在大介孔尺寸、高孔容以及表面大量Si-OH的共同作用下，LPMS的蛋白吸附能力達到了193.2 mg/g。