非諾貝特微球對高血脂模型大鼠降脂作用研究*

付 琳，蘇 瑾，楊春榮，孫維彤，張向宇，孟祥祎，張 杰

(佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

非諾貝特緩控釋是目前臨床上常用的一種降高血脂癥的藥物[1]。目前市面常見的劑型均為口服緩控釋制劑，口服緩控釋制劑多具有明顯的生物化學利用度相對較低、代謝緩慢和失活速度快的重要生理缺陷[2-4]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物是一種高分子載體材料，具有良好的成囊性和生物相溶性，并能在體內降解為乳酸和α羥基乙酸[5-7]。因此，制備非諾貝特PLGA微球新藥物有重要的臨床意義。通過對非諾貝特緩釋微球的研究[8-9]，將非諾貝特制成安全、穩定、高效的注射緩釋微球制劑，減少患者用藥次數，使藥物在體內緩慢釋放，為非諾貝特新劑型的臨床研究和應用提供理論依據。

1 材 料

1.1 儀 器

Guardcolumn C18色譜柱，日本島津；Agilent1100高效液相色譜儀，美國安捷倫公司； ZSM-6360LV掃描電鏡，南京大學儀器廠；SALD-2201激光粒度分布儀，蘇州島津儀器有限公司；UV765紫外-可見分光光度計，上海精科公司；HE3100紅外光譜測定儀器，德國SPECTRO；JY92-2D超聲波細胞破碎機，南京舜瑪儀器設備有限公司。

1.2 藥品與試劑

非諾貝特微球，佳木斯大學藥劑實驗室自制；非諾貝特(純度99%)，武漢宏信康精細化工有限公司；PLGA(PLA/PGA=50∶50，分子量10000)，山東濟南岱罡生物科技公司；非諾貝特對照品(純度99.9%)，中國食品藥品檢定研究所；磷酸鹽緩沖溶液(PBS7.4)，REBIO瑞楚生物；透析袋(36 mm，分子量8000～14000)，美國Viskase Size5。

1.3 動 物

SPF級雄性SD大鼠60只，哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供。合格證編號scxk(黑)2013001。

2 方 法

2.1 非諾貝特微球的形態學考察

通過光學顯微鏡觀察載藥微球形態特征，通過掃描電子顯微鏡觀察微球形貌。

2.2 非諾貝特微球粒徑及粒度分布

精密稱取適量微球進行溶解，超聲2 min使其分散均勻，激光粒度分布儀準確測定粒徑及粒度分布情況。

2.3 非諾貝特微球的紫外光譜掃描

使用容量瓶精密配置非諾貝特標準品和空白輔料溶液濃度10 μg·mL-1。以甲醇溶液為空白對照進行掃描，范圍200～400 nm。選擇合適的高效液相色譜檢測波長。

2.4 載藥微球體外釋放及穩定性研究

采用C18柱(250 mm×4.5 mm，5 μm)；以85∶15的乙腈、磷酸溶液混合溶液作為流動相；流速1.0 mL·min-1；紫外分光光度法測得檢測波長286 nm[10-11]。

精密配置10 μg·mL-1的非諾貝特對照品溶液，以甲醇為溶劑配置梯度濃度5、10、20、30、40、60、90 μg·mL-1在286 nm處進樣，繪制標準曲線。

2.4.1 透析法體外藥物釋放試驗

試驗采用透析袋原理。將微球注入5 mL生理鹽水的PBS 7.4介質中；在每個設定的取樣時間取樣量。釋放樣品的濃度用HPLC測定，代入體外釋放標曲計算非諾貝特的累積釋放量。

2.4.2 專屬性試驗

在不受其他雜質和輔料的干擾的條件下利用高效液相色譜檢測樣品特性。

2.4.3 精密度實驗

分別配置五個梯度濃度的樣品溶液，計算日內日間精密度。

2.4.4 穩定性檢測

每日取樣五次，測定樣品濃度計算峰面積。回收率：取高中低三個濃度樣品，每天測三次，連續測五天。

2.5 非諾貝特微球對高血脂模型大鼠降脂作用研究

2.5.1 動物分組與造模

分為正常組、高血脂疾病模型組、陽性對照組、非諾貝特微球高、中、低劑量組六組。造模期間正常組灌服等劑量的蒸餾水，其余5組灌服自制高脂乳劑。灌胃兩周后抽樣取血，測總膽固醇水平以證實高血脂疾病模型造模成功[12]。證實造模成功后大鼠開始藥物治療，非諾貝特緩釋微球高中低劑量組分別給予18、9、4.5 mg·kg-1濃度藥物。陽性對照組尾靜脈注射等劑量藻酸雙酯鈉，連續6 d，非諾貝特組三天注射一次，持續15 d。

2.5.2 檢查指標

大鼠給藥結束禁食24 h，將各組大鼠麻醉固定于鼠板上，腹部刨開進行腹主動脈血取，取肝臟、附睪脂肪和腎周脂肪，分別稱重記錄。計算體脂比和Lee’s指數。使用酶標儀測定血清的TG、TC、HDL、LDL水平和肝臟TC，TG水平。

3 結 果

3.1 非諾貝特微球的表征結果

在光學顯微鏡下觀察，載藥微球整體形態規整，無粘連。掃描電子顯微鏡觀察結果如圖1(a)所示，微球分布均勻，外觀呈完整球形，表面光整。激光粒度分布儀測定結果如圖1(b)所示，粒徑大小呈正態分布，平均粒徑為(1.16±0.14)μm。

圖1 微球SEM表面形貌(a)；微球的粒度分布(b)

3.2 非諾貝特紫外吸收波長測定

非諾貝特在286 nm處出現最大吸收峰，且與輔料的吸收峰的位置有明顯差異如圖2所示，因此在高效液相測定時選擇286 nm為檢測波長。

圖2 紫外吸收波長

3.3 非諾貝特PLGA微球體外釋放及穩定性研究

3.3.1 標準曲線的繪制

以286 nm為檢測波長，繪制標準曲線A=25.18C+26.75，r=0.9996，如圖3所示在5～90 μg·mL-1線性關系良好。

圖3 非諾貝特標準曲線

3.3.2 體外釋放考察

如圖4所示，經高分子材料修飾的載藥微球釋放時間得到顯著延長，非諾貝特微球達到了緩釋的效果。

圖4 非諾貝特微球釋放曲線

3.3.3 專屬性試驗

非諾貝對照品、原料藥、空白輔料和載藥微球的專屬性考察結果顯示輔料對原料藥出峰無影響。

3.3.4 精密度計算

平均日內精密度為RSD=1.601%，平均日間精密度RSD=1.348%，均小于2%，精密度結果良好，可以測定樣品。

3.3.5 穩定性

分別于0、1、2、4、8、12、16、24 h測定同一樣品濃度，計算峰面積分別為2018.56、2030.28、1985.42、2023.69、2039.6、2057.39、2069.45、2048.69 μg·mL-1。RSD為1.16%，小于2%，樣品溶液24 h內穩定。

3.3.6 回收率

測30、60、90 μg·mL-1高中低三個濃度溶液的平均回收率分別為98.55%、97.64%、96.92%。其RSD值分別為1.94%、1.7%、1.79%均小于2%，該方法準確度良好。

3.4 非諾貝特微球對高血脂模型大鼠降脂作用研究

3.4.1 各組大鼠腎周、睪周脂肪和體脂比的變化

結果如圖5所示，疾病模型組和各治療組動物的腎周、睪周脂肪，體脂比較空白組具有明顯區別。高血脂造模各組脂肪量均有增加，且給藥大鼠未顯示副作用。

圖5 腎周脂肪、睪周脂肪和體脂比的變化

3.4.2 各組大鼠對血清指標水平的影響

各組大鼠血清指標變化如圖6所示，模型組和空白組相比各水平指數均有顯著提高，高血脂癥造模成功。各治療組與模型組相比各指標均有下降，說明藥物可以對高血脂癥產生一定程度的治療作用，其中非諾貝特載藥微球高劑量組的治療效果最為顯著。

圖6 各組動物對血清TG、TC、LDL-C、HDL-C的影響

降低TNF-α可減少動脈粥樣硬化和血栓。如圖7所示，與模型組相比各治療組均可降低TNF-α水平，且具有統計學意義。各組大鼠對血清FIB的影響：降低FIB可促進血液中纖維蛋白原的溶解與釋放，降低纖溶。如圖7所示，陽性對照組和非諾貝特各劑量組均可降低血清FIB水平，且差異具有統計學意義。

圖7 各組動物對血清TNF-α和各組動物對血清FIB的影響

3.4.3 大鼠肝臟外觀形態觀察

各組大鼠肝臟形態如圖8所示。非諾貝特微球高中劑量組肝臟狀態較接近于正常組，表面呈紅褐色堅挺且有光澤。模型組大鼠肝臟顏色暗淡，體積偏大質地柔軟，肝緣頓且表面油膩。非諾貝特微球低劑量組與模型組十分相似，但低劑量組肝臟質地更硬。

圖8 各組肝臟外觀形態

4 結 論

高血脂癥是常見的中老年疾病，并與血壓血糖的異常息息相關，嚴重者還易導致動脈粥樣硬化，冠心病等。目前市場上的口服制劑生物利用度低，將非諾貝特制成緩釋微球制劑新藥物可以有效的提高其生物利用度，減少給藥次數。

實驗室制備非諾貝特微球。通過掃描電鏡、紅外光譜分析、差示量熱儀對載藥微球進行質量評價。成功制備交聯微球，表面光滑，形態均一完整，體外釋放效果良好。高效液相色譜在5～90 μg·mL-1范圍內測定載藥微球的藥物含量，線性關系良好。對大鼠進行體內的藥效學實驗，治療組TG、TC、LDL-C、TNF-α、FIB水平下降，HDLC和肝指數升高。非諾貝特微球具有緩釋的降脂作用，為非諾貝特新劑型開發提供了良好的理論依據。