IL-6與上皮性卵巢癌分期進展關系及其作用機制的生物信息學分析

張桐碩，劉金龍，趙 躍，王朵朵，宋姜楠，陳 曉，郭小芹，李艷秋，祝 峰

卵巢癌是致死率高的婦科腫瘤，對患者生理及心理產生巨大的危害。卵巢癌組織來源復雜，包括上皮性、間質性、生殖細胞來源。其中，上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是最常見的組織類型，占卵巢腫瘤的50%～70%，卵巢惡性腫瘤的90%～95%[1]。EOC發病隱匿，缺少令人滿意的腫瘤標志物，制約著EOC預后的改善，近15年我國卵巢癌生存率未見升高[2]。挖掘EOC發生、發展的調控分子，對尋找體外預警和監測方法等轉化醫學具有重要意義。炎癥與腫瘤的關系是近些年的研究熱點。炎性微環境在腫瘤的惡性演進中發揮促進作用，這一觀點被越來越多的模型證實[3]。天然免疫應答細胞釋放的炎性因子以旁分泌和自分泌的方式控制腫瘤的生長。其中，白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)被認為是銜接炎癥與腫瘤最為核心的炎癥因子。然而，既往關于EOC中IL-6的臨床報道多為簡單地比較外周血或腹水中IL-6水平的高低差異[4]，或用以評估預后表現[5]，缺乏與EOC分期整體性的相關性分析，而且對IL-6水平增高的成因闡述薄弱，其生物學意義尚待深入研究。本研究從EOC血清樣本出發，初步分析IL-6隨分期進展的變化趨勢，借助高效的生物信息學分析手段，進一步從基因層面分析IL-6的水平差異，為開發IL-6在EOC中的潛在價值提供新線索。

1 資料和方法

1.1 EOC血清中IL-6的水平檢測

1.1.1 研究對象 選取武警特色醫學中心婦科2017年2月—2018年6月間收治的原發性EOC患者21例，中位年齡51(25～77)歲。按國際婦產科聯盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)2013年版手術-病理分期標準，Ⅰ期7例，Ⅱ期5例，Ⅲ期6例，Ⅳ期3例。另收集我院同期收治的卵巢良性疾病患者12例作為陽性良性對照組，中位年齡42(17～60)歲，包括卵巢良性粘液性囊腺瘤4例、卵巢單純囊腫4例、巧克力樣囊腫2例及卵巢纖維瘤2例。健康體檢婦女30例作為正常對照組，中位年齡44(24～70)歲。所有對象均排除心、肝、腎等重要臟器疾患，不合并自身免疫性疾病，近期無感染。采血前均未行手術、放療或藥物治療。均與患者簽署知情同意書，研究經醫院倫理委員會批準。

1.1.2 樣本采集及檢測 抽取受檢者的靜脈血3 mL于促凝采血管中，3 000 r/min離心10 min，再取1 mL上清于無酶凍存管中，-80 ℃保存。待所有血樣收集完畢后，整批采用ELISA法檢測IL-6水平。人類IL-6免疫檢測試劑盒購自美國R&D Systems公司，OD值檢測使用美國Thermo Scientific公司的全自動酶標儀，具體操作嚴格按說明書。每個樣本以3次檢測的平均值作為其血清IL-6的水平。

1.2 EOC病理組織中IL-6基因表達水平及生物信息學分析

1.2.1 基因數據來源 從公共基因表達(gene expression omnibus，GEO)(http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數據庫下載EOC組織芯片數據集：GSE9891(285例)、GSE26193(107例)、GSE54388(16例)。從癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數據庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)下載Nature雜志發文總結的卵巢癌mRNA表達RNASEqV2數據集，包含489例高級別漿液性卵巢癌組織，覆蓋不同的FIGO分期，其中198例包含脈管浸潤的病理信息。

1.2.2 共同差異基因篩選 對各數據集樣本的IL-6 mRNA水平由高到低進行排序，前50%的樣本作為高表達組，后50%的樣本作為低表達組。對于GEO數據庫的3個數據集，通過GEO2R分析平臺(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)提取IL-6高、低分組間的差異基因。對于TCGA的數據集，利用R語言的Limma程序包提取差異基因。按照FDR<0.05,Log2FC>1的標準進一步篩選出各數據集中差異明顯的基因繪制Venn圖，選取在3個及以上數據集的交集基因用于后續分析。

1.2.3 GO和KEGG通路富集分析 使用DAVID在線生物信息學分析工具(https://david.ncifcrf.gov/)對篩選出的IL-6高、低表達組間的差異基因進行生物學注釋和分類，分別完成基因本體(gene ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書通路(the Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway，KEGG)富集分析。GO富集分析又分為生物學過程、細胞組分和分子功能3個類型板塊，每個類型取富集程度最高的6個條目作圖展示。

1.2.4 構建蛋白互作網絡 將篩選出的差異基因和IL-6導入STRING在線數據庫(http://string-db.org/)，獲得差異基因所編碼的蛋白質之間的相互作用。利用Cytoscape軟件對高度可信(結合系數大于0.7)的互作關系進行可視化處理，生成蛋白互作網絡圖。再利用Cytoscape的MCODE插件根據節點的拓撲特性對整個網絡進行聚類構建子模塊，定位IL-6所在的子網絡模塊，挖掘出與IL-6關系密切的關鍵節點蛋白。

1.3 統計學處理 應用SPSS 25.0軟件進行統計學分析；EOC與2個對照組的血清IL-6數據均呈非正態分布，故IL-6水平以中位數表示；組間比較采用非參數Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Bonferroni校正；TCGA數據庫中是否發生脈管浸潤的2組IL-6 mRNA比較采用Mann-Whitney U檢驗；血清IL-6水平與FIGO分期的相關性分析采用Spearman等級相關檢驗；以P<0.05為差異比較具有統計學意義。

2 結果

2.1 EOC患者血清IL-6的水平以及與FIGO分期的關系 正常對照組、良性對照組與EOC組的血清IL-6水平分別為5.88(3.83～6.87)pg/mL、13.24(8.53～27.70)pg/mL和27.76(14.57～80.92)pg/mL，整體間差異比較具有統計學意義(P=0.035)。經過3組之間的兩兩比較，只有EOC組高于正常對照組，差異比較有統計學意義(P=0.031)，圖1A。通過Spearman相關分析發現，血清IL-6與FIGO分期的等級數存在明顯正相關(r=0.79，P=0.002)，圖1B。

2.2 EOC組織IL-6 mRNA與脈管浸潤以及FIGO分期的關系 在TCGA數據的EOC樣本中，IL-6 mRNA在不同FIGO分期整體間有顯著差異(P=0.001)，且隨FIGO Ⅰ～Ⅲ依次升高(FIGO Ⅰ與Ⅱ：P=0.007，FIGO Ⅱ～Ⅲ：P=0.016)。Ⅳ期的IL-6轉錄水平出現回落(P=0.039)，圖2A。IL-6 mRNA的水平在脈管浸潤狀態下高于非浸潤狀態(P=0.027)，圖2B。

2.3 IL-6高、低表達組中的共同差異基因 從GEO和TCGA數據庫收集到4個數據集共計897例EOC樣本的基因表達譜。GSE9891、GSE26193、GSE54388和TCGA中符合篩選標準的差異基因各自有485個、417個、768個和1 260個，至少3個樣本集共有的差異基因有199個。相比于IL-6低表達組，高表達組中有156個表達上調，43個表達下調。

2.4 差異基因的富集分析 GO富集分析顯示，199個表達差異基因主要參與了細胞外基質的重塑、細胞粘附能力調控、膠原蛋白的合成以及中性粒細胞趨化作用引發的炎癥反應等一系列生物過程；參與合成的膠原蛋白、基底膜等產物多分布于細胞外基質，是腫瘤微環境的重要組分；參與的分子功能除構建細胞外基質外，還包括與調控肝素、整合素、細胞外基質分子與其配體的親和性，進而影響細胞和外環境的信號傳遞轉導。KEGG通路富集分析顯示，這些差異基因涉及的信號通路覆蓋細胞外基質受體互作、凝血功能、致癌因子等方面，主要有各類致病菌感染所激活的通路，調節慢性炎癥反應的Toll樣受體、NF-κB信號通路，以及與增殖和凋亡等生物效應密切相關的PI3K/Akt、TNF信號通路。

注：A:EOC組與對照組的血清IL-6水平(3組間Kruskal-Wallis H檢驗 P=0.035)；B:血清IL-6水平與FIGO分期的相關性分析圖1 EOC患者血清IL-6的水平以及與FIGO分期的關系

注：A:FIGOⅠ～Ⅳ期的IL-6 mRNA水平(4組間Kruskal-Wallis H檢驗 P=0.001)；B:EOC發生脈管浸潤與否的狀態下的IL-6 mRNA水平圖2 EOC組織IL-6 mRNA與EOC分期進展的關系

2.5 蛋白互作網絡分析 圖3展示了差異基因所對應蛋白的相互作用關系。IL-6在整個網絡中居于核心地位，周邊與IL-6結合系數較高的鄰接基因有SOCS3、FOS、IL8、CCL2、JUNB、IL7R、PTPRC(圖3A)。利用MCODE插件進行更深層的分子功能模塊挖掘，挑選出包含IL-6且聚類分值排序最靠前的子模塊，其內部節點為CCL2/3、C1QA/B、PTPRC、VSIG4、CD163，可能在IL-6調控的范圍內發揮重要作用(圖3B)。

注：基因節點均以圓圈表示，節點大小代表與該基因有直接互作關系的基因數目(連接度越高，圓圈越大)；節點之間連線的粗細代表其互作關系的結合系數；紅色節點代表上調基因，藍色代表下調基因圖3 卵巢癌IL-6相關差異基因的蛋白互作網絡圖

3 討論

IL-6可由單核-巨噬細胞、淋巴細胞、成纖維細胞和部分腫瘤細胞分泌至微環境中，并可以到達血液循環而被檢測到。既往絕大多數研究中可觀察到卵巢癌患者的血清IL-6高表達，并發現術前較高的血清IL-6水平與較短生存期或不良預后存在關聯。本研究亦得到相似結果，正常對照組、良性對照組與EOC組的血清IL-6平均值依次增高。然而，組間兩兩比較的結果顯示，EOC組與良性對照組未見顯著差異(P=0.318)，考慮是由于IL-6水平的個體差異較大，導致組間的別差不易出現統計學意義。本研究各組內的IL-6水平均呈偏態分布，與先前報道中的IL-6分布特點基本一致，因此，在分析IL-6與FIGO分期的關系時，不宜采取將不同分期拆分對比差異的統計方式，而應選用Spearman相關分析來評估IL-6隨分期進展的變化趨勢。結果顯示，血清IL-6與FIGO分期的相關系數較大，呈正相關。組織中的IL-6 mRNA變化趨勢與血清IL-6基本保持了一致。值得注意的是，IL-6 mRNA在脈管浸潤狀態下上調，而脈管浸潤的出現常提示EOC發生潛在轉移。可見IL-6與EOC的分期進展密切相關，對監測EOC的進程具備一定的開發應用價值。

探究IL-6在EOC惡性演進中相關基因和通路，有助于理解IL-6與以上病理特征的聯系，為IL-6的臨床應用提供理論依據。綜合GO和KEGG通路富集分析的結果發現，大部分差異基因所參與的功能和通路可歸納到上皮-間質轉化(epithelial-mensenchymal transition，EMT)的范疇。細胞重定位是EMT的重要步驟，即卵巢上皮細胞從基底膜轉移到膠原纖維構成的細胞外基質中[6]，而細胞外基質、細胞粘附能力及其附屬類別集中的IL-6相關差異基因數目最多。目前已有研究證實，IL-6可通過上調控基質金屬蛋白酶降解細胞外基質和基底膜，從而促進腫瘤細胞侵襲[7]。

KEGG通路富集分析包含多種感染性疾病，只代表IL-6在EOC中介導的慢性炎癥與細菌感染引起的炎癥啟動了相似的信號通路，包括了Toll樣受體、PI3K/Akt、NF-κB和TNF信號通路等腫瘤界的明星通路，與IL-6一同構成廣泛而復雜的EOC進展調控信號網絡。Toll樣受體是連接固有免疫和適應性免疫的紐帶，可能與腫瘤抗凋亡能力以及免疫逃逸有關。Szajnik等[8]研究發現，Toll樣受體相關激動劑可導致卵巢癌的NF-κB通路活性增加，并產生IL-6等炎癥因子。Wang等[9]發現IL-6可通過活化PI3K/Akt通路來增強卵巢癌細胞的粘附和侵襲能力。Kulbe等[10]報道，TNF-α可誘發產生血管生成因子,促進卵巢癌細胞的種植和新生血管的形成，而TNF-α基因敲除的卵巢癌細胞則表現出非侵襲性和高凋亡率。

深入分析IL-6相關差異基因的相互作用關系，發現CCL2、PTPRC和CD163不但在整個互作網絡中與IL-6的結合系數較高，而且出現在IL-6的功能子模塊中，這3個分子可能是IL-6調控卵巢癌的關鍵靶點。CCL2作為趨化因子家族的重要一員，能招募免疫抑制性白細胞聚集到卵巢癌細胞的周圍的微環境中，誘導其浸潤轉移[11]，推測IL-6可能通過升高EOC細胞表面CCL2的濃度從而提高其侵襲和轉移能力。CD163也被稱血紅蛋白清道夫受體，是單核-巨噬細胞活化的標記[12]。有學者認為CD163可以通過炎性因子影響凋亡相關蛋白的水平從而抑制細胞凋亡，還可以通過調節EMT參與腫瘤轉移[13]。PTPRC即CD45，免疫細胞如T細胞、B細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞表面均有表達，在Toll樣受體的信號轉導以及白細胞的粘附和遷移中發揮重要作用[14]。近年來的研究多集中在PTPRC對造血系統腫瘤的靶向治療，但尚未見PTPRC與卵巢癌的相關報道，其在卵巢癌中的意義還有待探索。

綜上所述，本研究發現血清IL-6在EOC中高表達，其升高程度與反映病灶轉移擴散情況的FIGO分期呈正相關。繼而通過生物信息學分析揭示，IL-6相關差異基因的功能特征主要集中在腫瘤侵襲和轉移方面，與IL-6水平隨分期進展而升高的規律相吻合，也解釋了作為腫瘤轉移始動因素的脈管浸潤伴發IL-6轉錄水平上調的現象。鑒于血清IL-6在人群中的基礎值范圍跨度較大，且特異性不強，雖然不足以用于卵巢癌的早期篩查，但有望作為一種無創的輔助指標追蹤卵巢癌的進程，并配合CA125、HE4等經典卵巢癌標志物，改善EOC的診斷與管理。