血漿1,5-脫水葡萄糖醇的UPLC-TQMS定量方法研究

瞿 純，葛 坤，菅朝慧，馬曉靜，包玉倩，賈 偉，趙愛華

1,5-脫水葡萄糖醇(1,5-anhydroglucitol，1,5-AG)與葡萄糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，為六碳糖醇，具有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)，由葡萄糖吡喃環(huán)狀結(jié)構(gòu)中1位上脫氧形成[1]。人體內(nèi)1,5-AG主要來源于飲食[2]，在腸道中被吸收，并分布到各種器官和組織中[3]。在健康狀態(tài)下，各組織間1,5-AG濃度水平相對穩(wěn)定[4]。當(dāng)發(fā)生糖尿病，血糖高于腎閾值時(shí)，會(huì)競爭性的抑制1,5-AG在腎近曲小管的重吸收，導(dǎo)致尿中1,5-AG排泄增加，血清中含量降低[5]。2003年，1,5-AG被美國食品藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)作為短期血糖監(jiān)測的指標(biāo)[6]。臨床上常用于監(jiān)控血糖水平波動(dòng)的指標(biāo)還有糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1C)、糖化白蛋白(glycatedalbumin，GA)和果糖胺(fructosamine，F(xiàn)A)等。HbA1C反映近3個(gè)月內(nèi)血糖的平均水平[7]，GA和FA可評估2～3周內(nèi)血糖控制情況[8-9]，而1,5-AG則可反映1～2周內(nèi)更短時(shí)間的血糖變化[2]。此外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，1,5-AG在反映餐后高血糖和血糖波動(dòng)方面也具有一定的優(yōu)勢[7]。

目前廣泛應(yīng)用的血清1,5-AG的定量方法主要為FDA推薦的GlycomarkTM試劑盒方法[10]。其原理首先用已糖激酶將干擾定量的葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，再將1,5-AG在吡喃糖氧化酶的作用下生成1,5-脫水果糖和過氧化氫，繼而在辣根過氧化酶的催化下生成比色產(chǎn)物，引起在特定波長下的吸光度升高[11]。該方法靈敏且精確，但必須去除血清中葡萄糖等類似物的干擾，才能特異性定量1,5-AG的含量。此外，早些年也有用氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)定量血清1,5-AG[12]，該方法首先需要去除樣本中的蛋白，再將去蛋白后的提取液濃縮干燥，加入硅烷化試劑進(jìn)行衍生。在特定的升溫程序下，根據(jù)化合物沸點(diǎn)的不同，分離目標(biāo)化合物，結(jié)合外標(biāo)法定量1,5-AG。此方法前處理較為復(fù)雜[13]。作者開發(fā)了一種利用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜(ultra-per-formance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-TQMS)定量血清1,5-AG的方法，樣本前處理簡單，不受血清中葡萄糖等干擾物質(zhì)的影響，檢測時(shí)間較短，可為臨床批量樣本的篩查提供一種簡便、快捷的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 UPLC-TQMS(型號(hào)：XEVO-TQ，美國Waters公司)，色譜柱ACQUITY UPLC?BEH Amide(2.1×100 mm，1.7 μm粒徑)，預(yù)柱VanGuardTMPre-column ACQUITY UPLC?BEH Amide(2.1×5 mm，1.7 μm粒徑)都選自美國Waters公司，EXP電子分析天平(瑞士Mettler Toledo儀器公司)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore儀器公司)。

1.2 試劑 1,5-脫水-D-葡萄糖醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)購自美國Sigma-Aldrich公司，內(nèi)標(biāo)(internal standard，IS)1,5-脫水-D-13C葡萄糖醇(1,5-anhydro-D-13C6-glucitol，13C6-1,5-AG，純度≥98%)購自美國Omicron Biochemicals公司。氨水購于美國Sigma-Aldrich公司，MS級別的乙腈和甲醇均購于美國Fisher Chemical公司。超純水由Milli-Q系統(tǒng)純化，=18.2。

1.3 研究對象 從上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院內(nèi)分泌科門診收集經(jīng)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)即口服75 g葡萄糖液體后，監(jiān)測血糖變化。根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)診斷為健康正常對照10例，糖尿病前期8例和糖尿病22例的空腹和2 h的靜脈血靜置2 h后，于1 200 r/min下離心20 min，取血漿-80 ℃保存，待用。樣本的臨床指標(biāo)見表1。

表1 健康對照與糖尿病人的臨床指標(biāo)

1.4 方法

1.4.1 樣本前處理方法 稱取1 mg同位素內(nèi)標(biāo)13C6-1,5-AG溶于1 mL甲醇中配制濃度為1 mg/mL的13C6-1,5-AG，取200 μL同位素內(nèi)標(biāo)母液加入含800 mL乙腈和200 mL甲醇的溶液中配制成提取溶劑。于50L的血漿中加入300 μL -20 ℃預(yù)冷過的提取液(含200 ng/mL13C6-1,5-AG)，渦旋30 s，使樣本與提取液充分混合，放置-20 ℃冰箱20 min后，于4 ℃、13 500 r/min離心10 min，取上清到進(jìn)樣瓶中待檢測。

1.4.2 色譜條件 柱溫45 ℃，進(jìn)樣體積5 μL，流速0.5 mL/min。流動(dòng)相A由乙腈∶異丙醇∶水(95∶5∶5,v∶v∶v)+0.05%氨水組成，相B由水+0.05%氨水組成。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

1.4.3 質(zhì)譜條件 采用負(fù)離子多重反應(yīng)監(jiān)測模式，電噴霧離子源。離子源溫度150 ℃，毛細(xì)管電壓2.0 kV，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流速1 000 L/h，錐孔流速50 L/h。1,5-AG及13C6-1,5-AG的定量離子見表3。

表3 1,5-AG和13C6-1,5-AG的定量離子

1.4.4 提取溶劑的選擇 為了有效地提取血清中的1,5-AG，本研究摸索了乙腈與甲醇在1∶0、8∶2、1∶1、2∶8、0∶1不同比例下的提取效果。采用所有測試樣本等量混合作為方法學(xué)考察所用樣本(quality control，QC)。平行取5份QC樣本，每份50 μL，分別加入以上預(yù)冷過的不同比例的提取溶劑300 μL，渦旋30 s，-20 ℃下放置20 min后，于4 ℃下，13 500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣。比較不同比例溶劑組合下1,5-AG的峰型及響應(yīng)強(qiáng)度，確定最佳提取溶劑。

1.4.5 檢測限、定量限和線性 將1,5-AG的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)存液用水稀釋為一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)對應(yīng)的濃度分別為檢測限(limits of detection，LOD)和定量限(limits of quantitation，LOQ)。在確定LOQ后，用1、2、4、8、10、15、20、25、40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，由低到高的順序進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，定量離子對的峰面積為縱坐標(biāo)，建立線性回歸方程，考察其線性。

1.4.6 重復(fù)性 分別取6份低(2 μg/mL)、中(10 μg/mL)、高(25 μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和6份QC樣本，以確定好的提取溶劑比例，平行提取樣本，取上清液進(jìn)樣測定。比較6針1,5-AG的峰面積，計(jì)算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.4.7 日內(nèi)精密度與日間精密度 取3等份QC樣本，1 d內(nèi)處理1個(gè)QC樣本，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算6針?biāo)玫?,5-AG峰面積的RSD，考察日內(nèi)精密度。3 d內(nèi)每天處理1個(gè)QC樣本，每天的樣本重復(fù)進(jìn)樣6針，連續(xù)3 d。計(jì)算3 d內(nèi)1,5-AG峰面積的RSD，考察日間精密度。

1.4.8 穩(wěn)定性 按確定好的方法，平行處理6份低、中、高的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和6份QC樣本，分別將提取液放置4 ℃下保存。于0、12、24、48、72 h和1周不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測試，每次重復(fù)進(jìn)樣6針。計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)1,5-AG峰面積的RSD。

1.4.9 準(zhǔn)確度 取6份低、中、高的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用確定好的提取溶劑，按相同的方法處理。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量低、中、高標(biāo)準(zhǔn)品溶液的實(shí)際濃度與理論濃度的比值，考察準(zhǔn)確度。

1.4.10 加樣回收率 平行取18份QC樣本，每6份中加入低、中、高不同濃度的1,5-AG標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用所確定的提取溶劑，按相同的方法進(jìn)行處理。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量未加標(biāo)準(zhǔn)品溶液的QC樣本以及加入不同濃度溶液后QC樣本中的濃度，計(jì)算加樣回收率。

1.4.11 方法驗(yàn)證 采用所確定的測定方法，定量10例健康對照、8例糖尿病前期和22例糖尿病血漿樣本中1,5-AG的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，相關(guān)性行Spearman相關(guān)分析，顯著性用t-test雙尾檢驗(yàn)，以P<0.05為差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 最佳提取溶劑的確定 5種不同比例的提取溶劑對應(yīng)1,5-AG的定量離子色譜圖，如圖1所示。結(jié)果顯示隨著甲醇比例的增加，色譜峰逐漸加寬，峰響應(yīng)越來越低，而乙腈比例越高，色譜峰越窄、對稱性好。雖然單純的乙腈作為提取溶劑時(shí)，峰型最窄，但峰響應(yīng)強(qiáng)度大約只有乙腈∶甲醇(8∶2，v∶v)的一半。綜合考慮，乙腈∶甲醇(8∶2，v∶v)的提取效果最好，1,5-AG色譜峰半峰寬較窄，峰型對稱，且響應(yīng)強(qiáng)度最大，是較理想的提取溶劑。

MEOH：甲醇；ACN：乙腈圖1 不同比例的提取溶劑的1,5-AG定量離子色譜圖

2.2 LOD值、LOQ值和線性關(guān)系 LOD值和LOQ值分別為0.002 5 μg/mL，0.005 μg/mL。在1～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性回歸方程為y=0.556 2x+0.067 8，相關(guān)系數(shù)r為0.998 8。表明1,5-AG在1～40 μg/mL的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，滿足定量的要求。

2.3 重復(fù)性 1,5-AG低、中、高標(biāo)準(zhǔn)品和混合血QC樣本的RSD為3.85%～6.08%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.4 日內(nèi)和日間精密度 日內(nèi)精密度RSD為3.77%，日間精密度RSD為7.76%。表明該方法具有良好的精密度，滿足定量的要求。

2.5 穩(wěn)定性 根據(jù)0、12、24、48、72 h和1周內(nèi)1,5-AG低、中、高標(biāo)準(zhǔn)品溶液及QC樣本1,5-AG的濃度所示，RSD為2.51～4.24%，表明1,5-AG在4 ℃環(huán)境下保存1周具有良好的穩(wěn)定性。

2.6 準(zhǔn)確度 1,5-AG低、中、高標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確度為97.28%～99.98%，RSD為2.72%～6.53%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

2.7 加樣回收率 平均加樣回收率為96.92%～101.53%，RSD為6.52%～9.82%，表明該方法具有良好的回收率。

2.8 方法驗(yàn)證結(jié)果 應(yīng)用將血清樣本采用所建立質(zhì)量的方法進(jìn)行1,5-AG濃度的測定。空腹時(shí)，糖尿病前期和糖尿病血中1,5-AG的濃度均分別低于健康對照(P<0.01和P<0.05)，但糖尿病前期與糖尿病之間差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A)。同樣，在OGTT 2 h時(shí)，糖尿病前期和糖尿病血中1,5-AG的濃度亦分別低于健康對照(均P<0.05)，并且糖尿病前期與糖尿病之間差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)。將本方法所測得的2 h血1,5-AG濃度與血糖值進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示血1,5-AG與餐后2 h血糖呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.51,P<0.01)，圖3。

A:空腹血漿，糖尿病前期與對照比較，**P<0.01(t=2.952，雙側(cè))；糖尿病與對照比較，*P<0.05(t=2.110，雙側(cè))；B:餐后2h血漿，糖尿病前期與對照比較*P<0.05(t=2.844，雙側(cè))，糖尿病與對照比較*P<0.05(t=2.425，雙側(cè))圖2 正常對照、糖尿病前期和糖尿病血漿1，5-AG濃度

r=-0.51,P<0.01圖3 餐后2 h血漿1,5-AG與餐后2 h血糖的相關(guān)性

3 討論

糖尿病患者的血糖水平監(jiān)控是診斷、治療中的重要依據(jù)。近年來，血清1,5-AG作為血糖監(jiān)控的短期標(biāo)志物而倍受關(guān)注，并且越來越多的研究者不僅關(guān)注血中1,5-AG的含量，同時(shí)還關(guān)注唾液、玻璃體液、腦脊液等不同生物體液中1,5-AG的含量。Halama等[10]的研究表明唾液1,5-AG可用于糖尿病的無創(chuàng)篩查。早期Servo等[14]研究者發(fā)現(xiàn)糖尿病患者腦脊液中1,5-AG的水平降低。此外，Takata等[15]在47具尸體中研究發(fā)現(xiàn)玻璃體和腦脊液中1,5-AG的水平呈正相關(guān)，可為法醫(yī)評估死者生前血糖水平提供重要的參考依據(jù)。由此可見1,5-AG在不同生物體液中具有重要的臨床價(jià)值。目前GlycomarkTM試劑盒檢測方法是通用的血中1,5-AG的定量方法，而1,5-AG在不同生物體液中的定量不僅受到樣本中葡萄糖的干擾，還受到膽紅素[16]、血紅蛋白[16]、麥芽糖[17]、肌醇[18]、半乳糖[10]等類似物的影響，在準(zhǔn)確定量前需要排除這些干擾因素。但去除干擾物的過程涉及到復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，需要嚴(yán)格控制溫度、反應(yīng)時(shí)間等條件，干擾物去除的與否完全會(huì)影響到測定1,5-AG的準(zhǔn)確性。本研究建立了基于UPLC-TQMS的一種定量方法。樣本前處理只需沉淀蛋白后即可上機(jī)檢測，整個(gè)檢測運(yùn)行過程僅需6 min即能完成。該方法具有較高的靈敏度、重復(fù)性好、高精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性，并且實(shí)際操作簡單、快捷，適合于不同生物大樣本的快速篩查需求，具有較強(qiáng)的推廣應(yīng)用價(jià)值。

本研究采用所開發(fā)的方法對健康對照、糖尿病前期和糖尿病患者中的血1,5-AG進(jìn)行了定量，結(jié)果顯示糖尿病前期和糖尿病患者的血1,5-AG的含量均顯著低于健康對照，這與文獻(xiàn)報(bào)道的用GlycomarkTM試劑盒測試糖尿病前期和糖尿病患者的結(jié)果相吻合[19]。但本次結(jié)果中提示糖尿病前期和糖尿病患者之間無顯著性差異，這很可能與所用的樣本數(shù)量較少、個(gè)體之間的差異較大有關(guān)。進(jìn)一步分析可知，餐后2 h的血糖與1,5-AG之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與葡萄糖和1,5-AG在腎小管中共用相同的轉(zhuǎn)運(yùn)體有關(guān)。當(dāng)尿中葡萄糖超過閾值后，轉(zhuǎn)運(yùn)體對二者的轉(zhuǎn)運(yùn)具有競爭性，對葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)增加，使血糖升高就會(huì)使得對1,5-AG的轉(zhuǎn)運(yùn)減少，血1,5-AG含量下降。該結(jié)果提示餐后的1,5-AG水平能較好反映餐后血糖的波動(dòng)情況，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相吻合[20]。

綜上所述，UPLC-TQMS檢測血清1,5-AG快速簡單，實(shí)現(xiàn)對血清1,5-AG準(zhǔn)確的定量，可為臨床高通量樣本的篩查提供切實(shí)可行的方法，同時(shí)也能為各種復(fù)雜生物樣本中1,5-AG的定量方法提供參考。