蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘導非酒精性單純性脂肪肝小鼠模型建立及動態觀察

朱文婭，常 艷

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指肝臟脂肪過多蓄積的一種疾病，確診依賴病理學，治療仍主要依靠生活方式的改善，還無經過循證醫學論證的治療藥物[1]。本病的疾病譜包括了非酒精性單純性脂肪肝(non-alcoholic simple fatty liver，NAFL)、脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、肝纖維化，也發現了部分患者可進展至晚期肝硬化、肝細胞癌[2]。其中NASH與NAFL的治療原則和流行病學調查二者的轉歸都有很大區別。因此，建立合適的NAFL動物模型對于了解這一階段疾病的病理生理特點具有較大價值。

目前，NAFLD動物模型主要包括由相關基因變異引起的遺傳性小鼠模型、飲食誘導的動物模型、獲得性和遺傳性相結合的動物模型。在這些模型中，遺傳性小鼠模型的建立一般通過改變NAFLD發病過程中的關鍵酶缺陷、瘦素基因等影響正常肝臟組織向NAFLD發展，但因其往往作用的環節單一，未模擬出NAFLD發展的缺陷，從而在研究NAFLD的病理生理機制上有所限制[3]。在飲食誘導的小鼠模型中，高脂飲食誘導模型最為經典，此類模型不僅可以誘導NAFLD的形成，而且可以導致小鼠超重、出現胰島素抵抗，與人類NAFLD的臨床表現相類似。蛋氨酸-膽堿缺乏飲食(methionine-choline-deficient diet,MCDD)誘導的小鼠模型是獲得性脂肪酸β-氧化減少小鼠模型的代表，它的作用機制在于減少了脂蛋白的合成，造成了甘油三酯(triglycerides，TG)在肝臟細胞的沉積，并且損傷了抗氧化屏障機制導致了氧化應激的增加[4]，在NAFL和NASH發生和發展的多個環節都產生作用。本研究選擇了MCDD誘導小鼠建立NAFL動物模型并進行動態觀察，為研究NAFLD發病機制提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料 24只SPF級8周齡、雄性C57BL/6小鼠，由北京科宇動物養殖中心公司提供，生產許可證號：SCXK(京)2018-0010；實驗動物使用許可證號：No.1103202011000301。實驗動物的飼養在SPF級實驗室中完成，所有操作均符合無菌原則。試驗性喂養1周后稱量小鼠體重均為20 g。

C-800全自動生化分析儀(美國Beckman公司)、可調式加樣器1000/100/10 μL(德國Eppendorf公司)、MULTIFUGE 3SR+臺式離心機(美國ThermoFisher Scientific公司)、電子天平(湘平ES-100K)、倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；輻照蛋氨酸-膽堿缺乏小鼠飼料。

1.2 研究方法 24只小鼠隨機分為觀察組(n=12)和對照組(n=12)。觀察組小鼠給予MCDD，對照組小鼠普通喂養飼料正常飲食,劑量根據小鼠體重分別劑量為12 g/(只·天)。均給予自由飲水、運動。在給予飼料后，每天觀察動物進食、飲水、行為、活動、精神狀態、毛發及二便等情況。

分別于實驗第8、15、22天各隨機抽取觀察組和對照組4只小鼠，處死后采集標本。取得小鼠肝臟制作石蠟切片、進行蘇木精-伊紅染色，對取得的小鼠肝臟組織蘇木精-伊紅染色切片置于光鏡下觀察，并根據2005年NASH臨床研究網絡病理委員會設計的NAFLD疾病譜組織學評分系統非酒精性脂肪性肝病活動度評分(non-alcoholic fatty liver disease active score，NAS)標準[5]對小鼠肝臟病理切片閱讀,進行評分、記錄。其中NAS≥5分者可明確NASH的診斷，NAS≤3分則可排除NASH，兩者之間者為NASH可能。

摘取小鼠眼球后采集新鮮靜脈血標本，留置于抗凝標本管內，靜置1 h，按2 500 r/min轉速離心，離心后取上層清亮血清標本。測定所取得小鼠血清中的丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)、TG的水平。

2 結果

2.1 小鼠一般情況 2組小鼠均未出現死亡，與對照組相比，觀察組小鼠的毛發紊亂、無光澤，體重明顯減輕，活動減弱，精神萎靡，進食量較正常小鼠減少，大便性狀明顯干結。

2.2 小鼠體重變化情況 通過對觀察組小鼠體重均數的觀察，MCDD小鼠體重呈下降趨勢，從第8天開始與起始體重(20 g)差異比較具有統計學意義(P<0.05)，提示第8天是小鼠體重明顯變化的時間節點(表1)；從實驗觀察的第8天起,MCDD小鼠與對照組小鼠的體重差異比較具有統計學意義(P<0.05,表2)。

表1 觀察組小鼠不同時間點與初始體重比較

表2 觀察組與對照組各觀察時間節點體重比較

2.3 肝臟大體情況和觀察組小鼠肝臟組織病理學評分

2.3.1 肝臟大體情況 分別于第8、15、22天處死觀察組小鼠及對照組小鼠。通過對新鮮肝臟樣本觀察可以得出，觀察組小鼠肝臟從第8天開始逐漸色澤加深、邊緣變鈍，整體呈腫脹表現，而對照組小鼠至第22天均未出現上述表現。

2.3.2 觀察組小鼠肝臟組織病理學評分 觀察組小鼠肝臟組織切片鏡下觀察可見：肝小葉內含脂滴細胞數明顯增加，脂滴彌漫浸潤，體積增大明顯、有空泡樣表現，部分腫脹呈圓，匯管區及小葉間可見炎細胞浸潤。對3次觀察組小鼠的肝臟病理切片進行組織學評分，表3。

表3 觀察組小鼠肝臟組織病理學NAS評分

觀察組小鼠肝臟組織大體和蘇木精-伊紅染色切片均可見明確的肝臟脂肪性變的特點，染色切片中從第8天起即可觀察到明顯肝臟脂肪變性。而在針對肝細胞是否發生明確炎癥的NAS評分中可發現，隨著時間的推移，NAS評分逐漸增高，而對照組小鼠至22天進行肝臟病理檢查均未見上述3種病變發生，評分均為0，提示了顯著的差異。至第15天觀察組小鼠NAS評分仍低于4分，且與第8天處死的小鼠NAS評分進行比較差異并無統計學意義(t=0.294,P>0.05)，而第22天處死小鼠的NAS評分和第8、15天差異比較均有統計學意義(t=2.601,P=0.04;t=3.57,P=0.019)。

2.4 小鼠血清中ALT、AST和TG的水平測定情況觀察組小鼠血清中ALT、AST水平較對照組有所上升，但差異比較并無統計學意義；隨造模時間的延長，均數呈上升趨勢，但在各時間節點的差異比較并無統計學意義。TG的水平也隨時間變化呈現增長趨勢，且各時間節點均與對照組差異比較具有統計學意義(t=2.35,P=0.017;t=2.491,P=0.013;t=1.99,P=0.033)，第22天與第8天差異比較具有統計學意義(t=3.29,P=0.023)，第15天則與第8天比較差異無統計學意義(t=0.366,P=0.373)。表4。

表4 小鼠血清中ALT、AST以及TG的水平測定結果

對所檢測的ALT和病理學評分進行了Pearson相關性分析，得出相關系數為0.574(P=0.032)，肝酶的升高與病理學評分呈正相關關系，但關系強度一般。

3 討論

NAFLD是一種以肝臟脂肪蓄積過多為特征的慢性肝臟疾病，其肝臟的病理表現與酒精性脂肪性肝病(alcoholic fatty liver disease，AFLD)類似，但因其發病人群無顯著乙醇攝入而認為與AFLD的致病機制及危險因素均不相同[5]。此種疾病的患病率在歐洲、北美等發達地區一直居高不下，在我國發病率有逐年上升的態勢，在北京、上海等發達富裕地區患病率已經高達15%[6]，成為了僅次于慢性病毒性肝炎的第2位的慢性肝臟疾病。作為NAFLD發病的初期，超聲和核磁對NAFL的敏感性并不強(脂肪浸潤程度>33%才可出現陽性表現)[7]，NAFL治療目前也無顯著推薦藥物，無論是診斷還是治療都存在不足之處。因此，研究NAFL的動物模型對于研究此類病變程度的NAFLD具有重要意義。

MCDD是指在喂養飼料中選擇性的不含有蛋氨酸及膽堿，一般認為2～4周的時間即可誘導小鼠產生脂肪性變甚至是NASH，并可繼續發生纖維性病變[8]。它誘導模型動物出現NAFLD的機制在于：①蛋氨酸是一種必須氨基酸，其提供的甲基用于形成膽堿，當缺少膽堿時，肝臟合成磷脂減少，不能有效地合成脂蛋白尤其是極低密度脂蛋白，從而使TG運出肝臟受阻、沉積在肝臟內，形成脂肪肝；②膽堿的減少會使得細胞膜中的卵磷脂會被代謝以提供膽堿，引起肝細胞膜損傷；③蛋氨酸、膽堿缺乏引起肝臟內嚴重缺乏抗氧化物，MCDD使抗氧化屏障機制受損并增加氧應激[9]；④氧應激還可以導致TNF-α等多種炎性因子激活[10]，并可激活IκKβ通道活化NF-κB，而NF-κB又是可以誘導TNF-α的轉錄因子，從而形成TNF-α—IκKβ通道循環，導致炎癥呈持續性發展；⑤CYP2E1上調引起自由基、超氧陰離子等的產生，導致肝臟細胞炎癥的發生[11]，自由基的大量形成可造成肝細胞膜等多部位和成分的廣泛損傷和肝纖維化。

本研究在通過MCDD誘導小鼠模型建立的過程中，把時間節點控制在每周處死小鼠進行病理學觀察，并根據2005年制定的NAS病理評分標準進行評分，得出結論是從第1周即出現了肝細胞的脂肪性變(評分>0分)，至第3周末可見小葉內炎癥、少量氣球樣變，但根據評分細則仍<5分，并且評分與第1周末未出現統計學差異，提示在第2周時間節點前小鼠的NAFLD病變發展程度控制在單純性脂肪性病變的水平。

本研究中盡管在每個時間節點的模型小鼠ALT、AST的均值均高于正常，并且表現出了隨時間延長呈上升趨勢，但和正常組小鼠比較差異無統計學意義，各時間節點的ALT、AST水平比較差異無統計學意義。ALT與病理評分的相關性分析表明ALT升高的程度和病理等級評分之間的相關性存在但并不密切，證實了把ALT的異常升高作為觀察NAFLD是否進展至NASH的做法是不完善的。有研究表明在ALT升高的NAFLD患者中出現炎癥、肝硬化的可能要高于ALT正常者，但發生進展期肝纖維化的可能是無差異的，并非所有的ALT正常的NAFLD患者都不會出現NASH、乃至肝硬化的可能[12]。

MCDD誘導的動物模型也存在以下不足之處：與多數NAFLD患者情況不同，誘導的動物模型大都出現體重下降，沒有肥胖的存在；胰島素抵抗不明顯[13]，部分動物實驗表明MCDD誘導的動物胰島素敏感性甚至出現增強的表現[14]；誘導形成NASH所用時間較短，和一般NAFLD從單純脂肪性病變過度到NASH需要較長時間的病理過程不完全符合；所需飼料為精確不含蛋氨酸及膽堿，配置難度較大，造模成本較高脂飲食高。