基于NF-κB信號通路的高壓氧干預對BMSCs移植治療脊髓損傷大鼠炎癥因子及血糖水平的影響

王 軍，桑衛(wèi)華，蘇 柯

脊髓損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種嚴重創(chuàng)傷，近年來其發(fā)生率呈現(xiàn)逐年增高趨勢，常導致?lián)p傷節(jié)段以下肢體嚴重功能障礙及神經(jīng)功能障礙[1]。炎癥反應是脊髓損傷的誘導因素之一[2]，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)移植是近年來脊髓損傷治療的研究熱點[3]，其可促進神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌，加速神經(jīng)纖維生長，抑制炎癥反應。高壓氧干預[4]是目前臨床常用的脊髓損傷治療手段，可有效改善病灶區(qū)域供氧，抑制神經(jīng)元凋亡，減輕炎癥反應。在脊髓損傷急性期BMSCs移植和高壓氧干預均可通過抑制炎癥反應來減輕病理損傷[5]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)是一類關(guān)鍵性的核轉(zhuǎn)錄因子[6]，有研究發(fā)現(xiàn)BMSCs移植和高壓氧干預可通過NF-κB信號通路改善脊髓損傷大鼠后肢運動功能[5]，但其對炎癥因子及血糖水平的影響尚不清楚。本研究基于NF-κB炎癥信號通路的高壓氧干預對BMSCs移植治療脊髓損傷大鼠白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)及血糖水平的影響進行了探討，以期為臨床治療脊髓損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SD大鼠40只，SPF級，雄性，3～4周齡，體質(zhì)量(90±10)g，購于上海生旺實驗動物養(yǎng)殖有限公司，生產(chǎn)許可SCXK(滬)2018-0001。40只大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后隨機分為假手術(shù)組、模型組、BMSCs組、BMSCs+高壓氧組，每組10只。

1.2 造模及干預 造模方法：采用改良Allen打擊法[5]制備大鼠脊髓損傷模型。假手術(shù)組僅咬除T9～10棘突及椎板，剪開硬脊膜，暴露脊髓，不損傷脊髓；縫合切口后放到飼養(yǎng)環(huán)境中，造模失敗大鼠剔除并隨機補足。模型組于造模1 h后尾靜脈注射1 mL PBS溶液；BMSCs組于造模1 h后尾靜脈注射1 mL BMSCs懸液(3×106個)；BMSCs+高壓氧組于造模1 h后尾靜脈注射1 mL BMSCs懸液(3×106個)，BMSCs注射完成后將大鼠置于高壓氧艙內(nèi)，純氧洗艙10 min，加壓至0.2 MPa，穩(wěn)壓50 min，期間維持氧體積分數(shù)>80%，隨后勻速減壓20 min至常壓，1/d，持續(xù)7 d。

BMSCs培養(yǎng)及鑒定：無菌條件下取SD大鼠雙側(cè)股骨與脛骨內(nèi)骨髓細胞，將細胞濃度調(diào)整至約1×106/cm2，加至4 mL含10%血清的低糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁后換液，待細胞融合度達到約85%，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶(山東西唐生物科技有限公司)消化后傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3～4代，細胞生長良好且生長密度達85%時于BMSCs懸液中加入大鼠抗大鼠CD29-FITC抗體(上海華壹生物科技有限公司)、CD90-PE抗體(上海信裕生物科技有限公司)、CD45-PE-cy5抗體(上海哈靈生物科技有限公司)、同型對照FITC(上海史瑞可生物科技有限公司)，各10 μL，25 ℃避光孵育0.5 h，無菌PBS重懸，細胞懸液采用流式細胞儀(北京科譽興業(yè)科技發(fā)展有限公司)鑒定后備用。

1.3 評價指標 ①大鼠后肢運動功能：于術(shù)后第8天采用Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)評分評定大鼠后肢運動功能，后肢運動功能分為22個級別，后肢運動功能完全正常為21分，后肢完全癱瘓為0分。將大鼠放入開口盆，輕敲盆壁使其爬行，由2人觀察大鼠后肢運動情況。每只大鼠用時5 min，評定3次，取2人得分的平均值。②TNF-α、IL-1β、血糖含量：各組大鼠后肢運動功能評定結(jié)束后采集其外周靜脈血5 mL，1 000 r/min離心20 min，分離血清，采用全自動生化分析儀(深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司)檢測血糖水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測TNF-α、IL-1β含量。③脊髓組織病理學變化：各組大鼠采血結(jié)束后將其處死，取其損傷中心處脊髓組織，蘇木素-伊紅染色顯微鏡下觀察染色結(jié)果。④脊髓組織中NF-κB、核因子κB抑制蛋白α(inhibitorg protein of NF-κB-α，IκB-α)蛋白水平：采用Western Blot檢測脊髓組織中NF-κB、IκB-α蛋白水平。取脊髓組織，加入RIPA裂解液，12 000 r/min離心20 min，取上清液，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量，將定量裂解后的樣品取100 μL加入25 μL 5×蛋白上樣緩沖液混勻，電磁爐煮沸15 min，用微量加樣器將煮沸后的樣品滴加到凝膠孔內(nèi)進行電泳，切膠，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉液(美國BD公司)封閉，PBST洗膜3次×5 min，加入1∶500稀釋的兔抗NF-κB單克隆抗體(美國CST公司)、1∶500稀釋的鼠抗IκB-α單克隆抗體(上海田源生物技術(shù)有限公司)、1∶500稀釋的兔抗GAPDH單克隆抗體(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次×5 min，加入1∶2 500稀釋的山羊抗大鼠IgG(武漢艾美捷科技有限公司)，25 ℃孵育60 min，PBST洗膜3次×5 min，ECL顯色劑孵育PVDF膜5 min，加入富士感光膠片，壓片、顯影、定影，使用Image J軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值比值代表目的蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠BBB評分 模型組、BMSCs組、BMSCs+高壓氧組大鼠BBB評分顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，BMSCs組、BMSCs+高壓氧組大鼠BBB評分顯著高于模型組(P<0.05)，BMSCs+高壓氧組大鼠BBB評分顯著高于BMSCs組(P<0.05)，表1。

表1 各組大鼠BBB評分

2.2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、血糖水平 模型組、BMSCs組、BMSCs+高壓氧組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、血糖水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，BMSCs組、BMSCs+高壓氧組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、血糖水平顯著低于模型組(P<0.05)，BMSCs+高壓氧組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、血糖水平顯著低于BMSCs組(P<0.05)，表2。

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、血糖水平

2.3 各組大鼠脊髓組織病理學變化 假手術(shù)組脊髓組織結(jié)構(gòu)完整，無出血腫脹，神經(jīng)組織形態(tài)正常，細胞核較大且輪廓清晰，無炎性細胞浸潤。模型組脊髓組織結(jié)構(gòu)不完整，有出血腫脹，神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)紊亂，細胞核裂解甚至消失，大量炎性細胞浸潤。BMSCs組脊髓組織結(jié)構(gòu)較清晰，有部分出血腫脹，神經(jīng)組織較連續(xù)，細胞核形態(tài)趨于正常，炎性細胞浸潤減少。BMSCs+高壓氧組脊髓組織病理損傷較BMSCs組明顯減輕(圖1)。

注：A，假手術(shù)組；B，模型組；C，BMSCs組；D，BMSCs+高壓氧組圖1 各組大鼠脊髓組織病理學變化(HE染色，×400)

2.4 各組大鼠脊髓組織中NF-κB、IκB-α蛋白水平模型組、BMSCs組、BMSCs+高壓氧組大鼠脊髓組織中NF-κB蛋白水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，IκB-α蛋白水平顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)；BMSCs組、BMSCs+高壓氧組大鼠脊髓組織中NF-κB蛋白水平顯著低于模型組(P<0.05)，IκB-α蛋白水平顯著高于模型組(P<0.05)；BMSCs+高壓氧組大鼠脊髓組織中NF-κB蛋白水平顯著低于BMSCs組(P<0.05)，IκB-α蛋白水平顯著高于BMSCs組(表3、圖2)。

表3 各組大鼠脊髓組織中NF-κB、IκB-α蛋白水平

注：A，假手術(shù)組；B，模型組；C，BMSCs組；D，BMSCs+高壓氧組圖2 各組大鼠脊髓組織中NF-κB、IκB-α蛋白水平

3 討論

脊髓損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷[7]，原發(fā)性脊髓損傷主要是暴力引起的血管、神經(jīng)破壞或斷裂，繼發(fā)性脊髓損傷則是在前者基礎(chǔ)上進一步引起的脊髓出血水腫、缺血再灌注、炎癥反應等[1]，炎癥反應是脊髓繼發(fā)性損傷一系列瀑布式反應的關(guān)鍵部分，有研究發(fā)現(xiàn)BMSCs移植和高壓氧干預在脊髓損傷急期均可通過抑制炎癥反應來改善脊髓組織病理性改變從而減輕脊髓損傷[5]。

BMSCs移植以其取材方便、移植痛苦小、移植費用低、不良反應小、移植病程短、感染率低等優(yōu)點引起國內(nèi)外學者廣泛關(guān)注[8]，成為近年來脊髓損傷修復的研究熱點。BMSCs具有自我更新快和可自體移植等特點，可分化為神經(jīng)細胞，分泌神經(jīng)生長因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)生長因子等，促進神經(jīng)元、軸突再生[9]；還可抑制炎性細胞活化，下調(diào)炎癥因子水平，減輕炎癥反應[10]。脊髓損傷后采用BMSCs移植療效較好，短時間內(nèi)就可以改善運動功能障礙，是治療脊髓損傷的有效手段[11]。高壓氧干預為缺血缺氧性疾病的常用治療手段，該法能夠修復血脊髓屏障，改善受損組織微循環(huán)，減少局部血容量，減輕組織水腫[12]；還能維持神經(jīng)細胞能量代謝，促進神經(jīng)細胞修復，促進軸突再生，改善運動及神經(jīng)功能[13]。本研究結(jié)果顯示BMSCs+高壓氧組大鼠BBB評分顯著高于模型組、BMSCs組，BMSCs+高壓氧組較模型組、BMSCs組脊髓組織腫脹明顯減輕，炎性細胞浸潤明顯減少，這同Geng等[14]研究結(jié)果一致，說明BMSCs移植和高壓氧干預可促進脊髓損傷大鼠運動功能恢復及損傷修復。NF-κB是炎癥反應過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，有研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷時NF-κB炎癥信號通路受到出血、缺氧等刺激，其抑制蛋白IκB-α被激活導致IκB蛋白磷酸化，NF-κB二聚體被釋放，與靶基因特定結(jié)合位點結(jié)合，導致神經(jīng)元細胞內(nèi)NF-κB表達增多，TNF-α、IL-1β等炎癥因子水平上調(diào)，而TNF-α、IL-1β又可進一步激活NF-κB炎癥信號通路，形成正反饋調(diào)節(jié)機制，使炎癥反應不斷放大，加重脊髓損傷[15]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論相符，本研究中BMSCs+高壓氧組大鼠脊髓組織中NF-κB蛋白水平顯著低于模型組、BMSCs組，IκB-α蛋白水平顯著高于模型組、BMSCs組，BMSCs+高壓氧組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量顯著低于模型組、BMSCs組，說明BMSCs移植和高壓氧干預可通過抑制NF-κB炎癥信號通路下調(diào)炎性因子TNF-α、IL-1β表達，減輕炎性反應。有研究發(fā)現(xiàn)[16]脊髓損傷后機體普遍存在不同程度高血糖，且高血糖與脊髓損傷患者致殘率密切相關(guān)，是影響脊髓損傷預后的重要因素之一。本研究結(jié)果顯示模型組大鼠血糖水平顯著高于假手術(shù)組，BMSCs+高壓氧組大鼠血糖水平顯著低于模型組、BMSCs組，提示BMSCs移植和高壓氧干預可能通過抑制NF-κB炎癥信號通路調(diào)節(jié)胰島B細胞分泌活動而降低血糖水平，促進大鼠脊髓損傷修復。

綜上所述，基于NF-κB信號通路的高壓氧干預能夠抑制BMSCs移植治療脊髓損傷大鼠炎癥因子表達，降低血糖水平，減輕脊髓損傷后病理變化，促進脊髓損傷修復，這可為治療脊髓損傷提供新的研究方向。