苦瓜提取物聯合脂肪干細胞移植對順鉑所致大鼠腎損傷的影響

于雅娟

臨床上醫者常將順鉑用于輔助治療多種腫瘤疾病，其療效較好，但是劑量過大或者使用時間過長將會引起腎臟等器官的嚴重中毒[1]。因此，研究順鉑急性腎損傷的防治具有重要意義。苦瓜中含有多種生物活性物質，可以保護腎臟免受糖尿病和阿霉素等誘導的損傷[2-3]。研究顯示，外源性脂肪干細胞移植后靶向性遷移到腎臟損傷部位，從而促進損傷的腎小管結構和功能的恢復[4-6]。本研究旨在探討苦瓜提取物和脂肪干細胞移植聯合治療順鉑所致腎臟損傷的療效及機制。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM/F12培養基、PBS(美國Hyclone公司)；晚期糖基化終產物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、Bcl-2和Bax兔抗大鼠多克隆抗體(美國Santa Gruz公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(英國Abcam公司)；胰蛋白酶、TRIzol試劑、逆轉錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。清潔級成年雄性SD大鼠75只，體質量200～250 g，由北京維通利華動物實驗技術有限公司提供，生產許可證號：SCXK(蒙)2014-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK(蒙)2014-0002。大鼠于室溫25 ℃，濕度60%～70%，SPF環境下自由飲水和采食。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪干細胞復蘇與PKH-26標記 鼠脂肪干細胞迅速放入37 ℃恒溫水浴箱中，在30 s內快速復蘇后，稀釋、離心、棄上清、洗滌細胞后用DMEM完全培養液重懸細胞，并調細胞濃度為1×106/mL，MTT法檢測不同時間點細胞增殖活化能力，培養箱取出細胞，更換新培養液，各孔加入20 μL 5 g/L MTT，振蕩均勻，放入細胞培養箱培養4 h，棄掉各孔上清液，加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，酶標儀測定各孔吸光度值。在細胞培養箱中培養7 d之后離心、棄上清、洗滌細胞，將細胞濃度調整到1×106/mL，對細胞行PKH-26標記，顯微鏡觀察。

1.2.2 順鉑腎損傷模型建立及分組 75只SD大鼠隨機選15只為對照組，將剩余大鼠經尾靜脈給予5 mg/kg順鉑，每周注射1次，連續3周，建立順鉑誘導的大鼠腎臟損傷模型(參與造模的60只大鼠血液中肌酐和尿素氮水平顯著高于造模前)。將建模成功的60只大鼠隨機分為模型組、苦瓜提取物組、脂肪干細胞組及聯合治療組，每組15只。造模成功后24 h，脂肪干細胞組大鼠經尾靜脈注射0.5 mL 1×108/L的脂肪干細胞懸液，苦瓜提取物組大鼠灌胃80 mg/kg苦瓜提取物，聯合治療組大鼠同時給予脂肪干細胞懸液和苦瓜提取物。對照組和模型組尾靜脈注射0.5 mL DMEM/F12培養液。上述干預措施1/d，連續7 d。

1.2.3 血清肌酐和尿素氮水平測定 治療7 d，每組隨機取3只大鼠，采集尾靜脈血必要時聯合內眥靜脈采血2 mL，分離血清，全自動生化分析儀檢測血清肌酐和尿素氮水平。

1.2.4 尿液中NAG、γ-GT和尿蛋白水平測定 治療7 d，每組隨機取3只大鼠，收集24 h尿液，按照試劑盒說明書操作，測定大鼠尿N-乙酰-β-D-葡萄(N-acetyl-b-D-glucosaminidase，NAG)、尿γ-谷氨酰轉肽酶(γ-glutamyltranspeptidase，γ-GT)和尿蛋白水平。

1.2.5 蘇木精-伊紅染色 治療7 d，每組隨機取3只大鼠，麻醉后處死，取出腎臟組織，加入10%甲醛固定，制備腎組織切片，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，行浸蠟包埋，將包埋好的蠟塊于切片機上，切成5～8 μm薄片，再貼到載玻片上，45 ℃烘干，脫蠟后行蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察。

1.2.6 熒光顯微鏡觀察 治療7 d，取各組大鼠腎臟組織制備冰凍切片。顯微鏡下每張冰凍切片隨機選取3個視野拍照記錄；假設每張照片的總亮度為1，為每張照片選取一個光亮度點，利用ACDSee 5.0軟件確定其坐標。在圖像中隨機選取8個視野，觀察PKH-26標記脂肪干細胞的存活和分布。

1.2.7 TUNEL法檢測 治療7 d，取各組大鼠腎臟組織制作石蠟切片后脫蠟，向切片上滴加復合消化酶進行室溫孵化20 min；洗滌后滴加50 μL TUNEL標記反應混合液，在濕盒中37 ℃孵育1 h，滴加POD2轉化液50 μL；濕盒37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色；行蘇木精-伊紅復染后在熒光顯微鏡下觀察計算凋亡率。

1.2.8 RT-PCR檢測 治療7 d，每組選取3只大鼠，麻醉后取腎臟組織于冰上充分研磨后迅速加入TRIzol試劑裂解細胞抽提總RNA。根據反轉錄說明書合成相應的cDNA并進行擴增。擴增條件均為94 ℃預變性1 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33個循環。RAGE上游：5′-CACCTTCTCCTGTAGCTTCA-3′，下游：5′-TGCCACAAGATGACCCCAAT-3′；ROS上游：5′-ACGGACCCAAAGAGTTAG-3，下游：5′-GTTAGCGTTAGACGGAGC-3′；Bax上游：5′-ACACCTGAGCTGACCTTGGA-3′，下游：5′-CCGTGTCCACGTCAGCAATC-3′；Bcl-2上游：5′-GGTGGTGGAGGAACTCTTCA-3′，下游：5′-ATGCCGGTTCAGGTACTCAG-3′；GAPDH上游：5′-GCCAAGTATGATGACATCAA-3′，下游：5′-CCATATTCATTGTCATACCA-3′。以GAPDH基因為內參，測定RAGE、ROS、Bax、Bcl-2的mRNA相對表達水平。

1.2.9 Western Blot檢測 治療7 d，取凍存腎組織，加入裂解液制成勻漿液，離心取上清，BCA法測定總蛋白濃度。對變性后的蛋白行10%SDS-PAGE凝膠電泳；濕轉法轉膜至PVDF膜，TPBS洗滌；5%脫脂牛奶4 ℃封閉過夜；加入RAGE、ROS、Bax、Bcl-2一抗室溫孵育1 h，TPBS洗滌；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗室溫孵育1 h，TPBS洗滌；用ECL發光試劑盒進行顯色，掃描圖像并半定量分析，測定各組腎臟組織中RAGE、ROS、Bax、Bcl-2蛋白相對表達水平，以GAPDH為內參。

2 結果

2.1 各組大鼠血清肌酐及尿素氮水平比較 經驗證造模成功。干預治療7 d后，模型組大鼠血清肌酐和尿素氮水平均高于對照組(P<0.05)；脂肪干細胞組及苦瓜提取物組鼠血清肌酐和尿素氮水平均明顯低于模型組(P<0.05)，聯合治療組大鼠血清肌酐和尿素氮水平低于單獨治療組(P<0.05)。表1。

表1 大鼠血清肌酐及尿素氮水平

2.2 各組大鼠尿NAG、γ-GT和尿蛋白水平比較 與對照組比較，腎臟損傷模型組大鼠尿液中NAG、γ-GT和尿蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較苦瓜提取物組和脂肪干細胞組大鼠尿液中NAG、γ-GT和尿蛋白水平顯著降低(P<0.05)，而聯合治療組大鼠上述指標則進一步下降(P<0.05)。表2。

表2 大鼠尿NAG、γ-GT和尿蛋白水平

2.3 大鼠腎臟病理形態變化 光鏡觀察，對照組(圖1A)大鼠腎臟腎小球豐富，輪廓清新、腎小管排列規則；模型組(圖1B)大鼠腎臟部分細胞胞核消失，腎小管結構混亂，可見胞漿空泡，腎臟結構病變嚴重。苦瓜提取物組(圖1C)及脂肪干細胞組(圖1D)大鼠腎臟腎小球數量較模型組增多，部分區域可見腎小管結構，但顯示欠清晰；腎小球局部區域尚可分辨，較對照組模糊，腎臟組織空泡化減輕，病變有所緩解。聯合治療組(圖1E)大鼠腎臟組織未見明顯的胞漿空泡化，與單獨治療組相比腎臟恢復更為明顯。

圖1 大鼠腎臟病理形態變化(×40)

2.4 脂肪干細胞存活和分布情況 對照組、模型組和苦瓜提取物組大鼠腎臟組織中未見有PKH-26標記的脂肪干細胞，脂肪干細胞組和聯合治療組大鼠腎臟組織中可見PKH-26標記的脂肪干細胞，聯合治療組大鼠腎臟組織中陽性脂肪干細胞數量[(62.48±8.68)個/高倍視野]明顯高于脂肪干細胞組[(32.64±4.76)個/高倍視野]。

2.5 各組大鼠腎臟細胞凋亡情況 與對照組[(1.14±0.08)%]比較，模型組大鼠腎臟細胞凋亡率[(15.79±0.14)%]顯著升高(P<0.05)；脂肪干細胞組[(9.10±0.12)%]和苦瓜提取物組[(9.14±0.10)%]大鼠腎臟細胞凋亡率顯著低于模型組[(15.79±0.14)%](P<0.05)；與脂肪干細胞和苦瓜提取物單獨治療組比較，聯合治療組大鼠腎臟細胞的凋亡率[(4.82±0.05)%]則進一步降低(P<0.05)。

2.6 各組大鼠腎臟組織中RAGE、ROS、Bax、Bcl-2 mRNA表達水平 與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中的RAGE、ROS和Bax mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，脂肪干細胞組和苦瓜提取物組大鼠腎臟組織中RAGE、ROS和Bax mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，聯合治療組大鼠RAGE、ROS和Bax mRNA表達水平最低(P<0.05)。與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；脂肪干細胞組和苦瓜提取物組大鼠腎臟組織中Bcl-2 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，聯合治療組Bcl-2 mRNA表達水平較高(P<0.05)，見圖2。

圖2 腎臟組織RAGE、ROS、Bax、Bcl-2 mRNA表達

2.7 各組大鼠腎臟組織中RAGE、ROS、Bax、Bcl-2蛋白表達水平 與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中的RAGE、ROS和Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，脂肪干細胞組和苦瓜提取物組大鼠腎臟組織中RAGE、ROS和Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，聯合治療組大鼠RAGE、ROS和Bax蛋白表達水平最低(P<0.05)。與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；脂肪干細胞組和苦瓜提取物組大鼠腎臟組織中Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，聯合治療組Bcl-2蛋白相對表達水平較高(P<0.05)。

3 討論

隨著順鉑在臨床上應用的增多，大劑量順鉑的毒性已經越來越受到關注[7]。臨床上對于順鉑毒性的防治常常使用藥物促進其排泄，但是這些藥物需要靜脈滴注，且本身也具有不良反應[8]。苦瓜中含有豐富的生物活性成分，其在腎臟保護方面作用顯著。干細胞是一類具有多向分化潛能的多能細胞，研究表明其參與多種受損組織的修復[9]。脂肪干細胞因其易于獲得、遺傳穩定、可快速擴增，為代謝性疾病的治療帶來了新希望[10]。Atashi等[11]研究表明脂肪干細胞在治療腎損傷等疾病方面具有巨大潛力。

本研究通過注射順鉑構建腎臟損傷模型，造模后大鼠血清尿素氮、肌酐含量、尿液中NAG、γ-GT及尿蛋白含量明顯高于造模前，由此可知大鼠腎臟過濾功能受到嚴重的損傷。經過不同干預治療后，脂肪干細胞組和苦瓜提取物組大鼠血清肌酐、尿素氮及尿NAG、γ-GT、尿蛋白含量均顯著降低，聯合治療組上述指標進一步降低。蘇木精-伊紅染色結果顯示脂肪干細胞組和苦瓜提取物組腎臟組織學形態明顯改善，聯合治療組改善更明顯。熒光顯微鏡觀測結果顯示聯合治療組中PKH-26標記的脂肪干細胞較多，苦瓜提取物可以促進脂肪干細胞在腎臟組織中的存活和分布。TUNEL細胞凋亡率結果顯示，模型組中腎臟細胞凋亡率顯著升高，脂肪干細胞和苦瓜提取物單獨治療可以緩解因順鉑引發的腎臟細胞凋亡，聯合治療組中的腎臟細胞凋亡率顯著低于單獨治療組。

本研究從分子生物學角度分析苦瓜提取物聯合脂肪干細胞移植的抗凋亡作用，結果顯示聯合治療組RAGE、ROS、Bax mRNA和蛋白表達水平較苦瓜提取物組、脂肪干細胞組明顯下調，Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平上調亦明顯。RAGE與AGEs相互作用導致細胞氧化-抗氧化防御系統失衡，造成ROS生成增多，促進氧化應激。順鉑引起的腎臟毒性會引起腎臟組織中RAGE-ROS信號通路表達水平上升，進而引起ROS集聚，導致腎臟組織發生病變。研究結果表明，苦瓜提取物和脂肪干細胞聯合治療顯著緩解順鉑毒性引發的氧化應激。

在細胞代謝調節中，Bax蛋白可激活線粒體通透性轉化孔的開放，引起線粒體結構和功能紊亂，Caspase激活蛋白外流，細胞凋亡；而Bcl-2表達上調可以抑制細胞凋亡，為凋亡抑制基因，是抑制凋亡蛋白酶激活的關鍵因素[12]。研究結果顯示聯合治療組腎臟組織中Bax表達水平下調，Bcl-2表達水平上調，保護了腎臟細胞免受順鉑引起的凋亡。本研究因試驗條件有限，對于苦瓜提取物、脂肪干細胞作用機制的研究尚不足，在今后的研究中將進一步深入研究，盡可能從多條可能的通路進行探討。